猪巨噬细胞感染不同基因型弓形虫后的转录组研究

摘要

刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病，可以感染几乎所有的温血动物，通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量，进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。近些年来，随着经济的增长，人们生活水平的不断提高，对猪肉的需求大幅上涨，然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失，同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足，尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此，国内外许多科研工作者建立动物模型，用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。
　　本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化，鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径，发现不同基因型弓形虫在调控型Ⅰ干扰素和NF-κB信号通路的差异，通过弓形虫感染BALB/c小鼠，利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化，同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制，将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞，研究其对免疫因子的影响。
　　(1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析
　　将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞，利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化，发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加，Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株，进行GO富集和KEGG分析，三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。
　　(2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响
　　通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠，根据不同基因型弓形虫的毒力，设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示，在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中，IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显，且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地，PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低，且随时间变化不太明显。
　　(3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制
　　将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞，利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达，发现p-IκB的表达水平显著增加，当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。
　　(4)GRA15对RAW264.7细胞因子的影响
　　使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中，分别收集12h和24h的细胞，通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明，GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(Ⅰ)和GRA15(Ⅱ)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(Ⅰ)、GRA15(Ⅱ)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、iNOS和PD1均无明显影响。
　　本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析，描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时，在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制，促进对弓形虫感染的预防和控制，了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略语表

1．文献综述

1．1 弓形虫概述

1．1．1 弓形虫的特征

1．1．2 弓形虫的生活史

1．1．3 弓形虫的流行及危害

1．2 弓形虫免疫学

1．2．1 先天性免疫

1．2．2 获得性免疫

1．2．3 IFN-γ诱导的效应机制

1．2．4 Ⅰ型干扰素

1．2．5 宿主NF-κB反应

1．3 转录组测序的应用

2．研究目的和意义

3．材料和方法

3．1 实验材料

3．1．1 实验动物

3．1．2 虫株、菌株和细胞

3．1．3 载体和质粒

3．1．4 引物

3．2 主要仪器和试剂

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要溶液的配置

3．3 实验方法

3．3．1 弓形虫速殖子的培养与收集

3．3．2 弓形虫速殖子总RNA的提取

3．3．3 转录组测序

3．3．4 cDNA的制备

3．3．5 Real-time PCR反应

3．3．6 数据分析方法

3．3．7 小鼠感染实验

3．3．8 哺乳动物细胞的复苏与传代培养

3．3．9 GRA15调控NF-κB信号通路的机制研究

3．3．10 GIA15电转染RAW264．7细胞

4．结果与分析

4．1 样品RNA质量检测的结果

4．2 测序数据质量情况汇总

4．3 参考序列比对分析

4．4 基因表达水平分析

4．5 RNA-seq整体质量评估

4．6 差异表达分析

4．6．1 差异表达基因的列表

4．6．2 差异基因的聚类分析

4．7 生物信息学分析

4．7．1 弓形虫RH组6小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．2 弓形虫RH组12小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．3 弓形虫RH组24小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．4 弓形虫HB1组6小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．5 弓形虫HB1组12小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．6 弓形虫HB1组24小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．7 弓形虫Me49组6小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．8 弓形虫Me49组12小时和NC组比较的生物信息学分析

4．7．9 弓形虫Me49组24小时和NC组比较的生物信息学分析

4．8 涉及免疫途径的差异基因分析

4．9 Real-time PCR验证差异表达基因的表达水平

4．10 不同基因型弓形虫对小鼠先天性免疫细胞因子的影响

4．11 GRA15对宿主免疫途径的影响

4．11．2 GRA15对小鼠RAW264．7细胞的先天性免疫细胞因子的影响

5．讨论

5．1 转录组数据分析讨论

5．2 不同基因型弓形虫株对小鼠脾脏的细胞因子的影响

5．4 GRA15对RAW264．7细胞的免疫因子的影响

6．结论

参考文献

致谢