高压CO2对全蛋液的杀菌效果及机理的初探

摘要

液蛋生产上常采用热处理进行灭菌，其方法不可避免导致液蛋中的蛋白质发生变性聚集，营养物质损失。本课题为了解决此问题，利用高压CO2杀菌技术应用液蛋中致病菌和腐败菌杀菌时并保证液蛋的功能特性，为高压CO2杀菌技术在蛋制品应用提供基础。主要研究内容如下:
　　1.高压CO2对全蛋液中沙门氏菌致死效果的研究。通过单因素实验和响应面实验优化高压CO2杀菌条件。压力、温度、时间、搅拌速率对沙门氏菌的致死均有显著影响，且压力和温度间的相互作用对沙门氏菌的致死程度不明显。最佳杀菌条件为30MPa，40℃，60min、125r/min时，能够将全蛋液中3×106～3×107CFU/mL的沙门氏菌达到完全杀灭。经PI染色后，高压CO2使全蛋液中沙门氏菌的细胞膜受损程度大于巴氏杀菌组、未处理组。4℃下贮藏，与原蛋液的货架期比较，经过巴氏杀菌、高压CO2处理的全蛋液货架期分别延长了9d、39d。
　　2.高压CO2对全蛋液的功能特性的变化。结果显示在30MPa、125r/min、40℃下，当高压CO2处理60min时，与未处理全蛋液比较，起泡能力和稳定性分别提高了26.68％和41.49％;处理时间大于30～60min时乳液粒径逐渐减小，乳液电位增加，显微镜下乳液液滴分散均一，液滴体积减小，乳液的乳化能力和稳定性提高;不同时间处理下凝胶强度显著减小(p＜0.05)。低场核磁分析得到经过高压CO2处理后，全蛋液的水分变得更加自由，导致全蛋液的持水能力比未处理、巴氏杀菌的全蛋液显著降低(p＜0.05)。高压CO2处理后全蛋液的粘性、弹性模量和粘性模量分别降低。然后从蛋白质的理化性质和结构分析这些功能性质变化机理，得出在15～60min时，高压CO2引起蛋白质溶解度增加游离巯基含量逐渐增加，表面疏水性增加，导致蛋白质的空间结构展开，随着高压处理时间超过60min后蛋白至溶解度下降，游离巯基含量、表面疏水性下降。SDS-PAGE表明高压CO2没有改变蛋白质的组成成分。
　　3.4℃贮藏下全蛋液和蛋清液腐败菌的分离与鉴定。全蛋液和蛋清液分别在9d、35d达到腐败变质。通过高通量测序技术和16r sDNA测序鉴定出全蛋液腐败菌分别为蜡状芽孢杆菌、液化沙雷菌、粪肠球菌;蛋清液分离出的腐败菌分别为液化沙雷菌、粪肠球菌、甲基营养型芽胞杆菌、荧光假单胞菌、阴沟肠杆菌。液化沙雷氏所分离的菌株最多，占33.96％。且6种菌株的水解蛋白质能力大小为:粪肠球菌＞阴沟肠杆菌＞液化沙雷氏菌＞假单胞菌＞蜡样芽孢杆菌＞甲基营养型芽孢杆菌。
　　4.考察高压CO2杀菌技术对6种腐败菌的致死效果。利用Logistics模型拟合6种腐败菌的失活曲线。结果表明在30MPa、40℃、125r/min条件下对液化沙雷氏菌在处理25min才达到完全杀灭，阴沟肠杆菌和荧光假单胞菌、甲基营养型芽孢杆菌分别在15、22.5、20min完全被抑制，且而对于蜡样芽孢杆菌和粪肠球菌均在75min时才达到完全杀灭。最后模拟6种菌株的混合体系，0.6μL/mL的牛至精油与高压CO2协同20min完全杀灭混合菌，PI的通透率与致死率变化一致，而高压CO2在处理70min时才达到4.26。25℃下贮藏发现，与原全蛋液比较，高压CO2与牛至精油协同使液蛋货架期延长20d，高压CO2延长至10d。
　　5.初步探讨菌体受高压CO2处理后的致死机理。OD600值和致死率表明压力为18、30MPa时粪肠球菌完全被杀灭;而在30MPa下沙门氏菌存活率才为0。进一步通过扫描电镜分析发现18MPa下，粪肠球菌细胞表面发生聚集粘合，细胞形态完全被改变;而沙门氏菌细胞形态在30MPa下变得更加严重。流式细胞仪结果表明在18MPa下粪肠球菌有92.7％的菌存在亚致死状态，当压力大于18MPa时，粪肠球菌的死亡数目达到43.8％，沙门氏菌在30MPa下死亡数量达到79.3％;高压CO2杀菌后粪肠球菌、沙门氏菌的细胞膜均被破坏、脂酶活性降低。SDS-PAGE结果表明高压CO2均能诱导使粪肠球菌、沙门氏菌细胞膜上的蛋白质都发生降解。两种菌均存在DNA被降解的现象，但粪肠球菌的降解程度小于沙门氏菌。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 液蛋

1．1 液蛋的应用

1．2 液蛋中特定微生物及污染

1．3 液蛋保鲜方法

2 冷杀菌技术

2．1 高压脉冲电场杀菌技术

2．2 辐照杀菌技术

2．3 超高压杀菌技术

2．4 微滤技术

2．5 生物抗菌剂

2．6 高压CO2杀菌技术的发展现状

3 研究目的与主要内容

3．1 研究目的

3．2 课题研究内容

第二章 高压CO2处理对全蛋液杀菌条件的优化

1 材料与方法

1．1 材料与设备

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 沙门氏菌的生长曲线

2．2 单因素试验结果

2．3 响应面优化杀菌条件试验与结果分析

2．4 荧光显微镜

2．5 贮藏期间蛋液货架期评价

3 讨论

4 结论

第三章 高压CO2对全蛋液功能特性的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果分析

2．1 全蛋液溶解度的变化

2．2 全蛋液起泡性质的变化

2．3 全蛋液乳液性质变化

2．4 凝胶强度变化

2．5 低场核磁变化

2．6 流变学性质的变化

2．7 游离巯基含量变化

2．8 表面疏水性的变化

2．9 SDS-PAGE

3 讨论

4 结论

第四章 低温贮藏中液蛋腐败菌的分离与鉴定

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 低温储藏过程中蛋清液和全蛋液pH的变化

2．2 低温储藏过程中全蛋液和蛋清液的TVB-N的变化

2．3 低温储藏过程中全蛋液和蛋清液的菌落总数变化

2．4 生理化实验鉴定结果

2．5 菌株水解蛋白能力的评价

2．6 高压CO2杀菌技术的发展现状

3 讨论

4 结论

第五章 高压CO2对全蛋液中特定腐败菌杀菌效果研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 各个菌株的生长曲线

2．2 高压CO2对6种菌株的致死效果

2．3 Logistic模型参数的验证

2．4 高压CO2协同牛至精油对混合菌的失活影响

2．5 混合菌的再生长能力的测定

2．6 25℃贮藏期间pH、菌落总数、TVB-N变化

3 讨论

4 结论

第六章 高压CO2对粪肠球菌和沙门氏菌致死机理研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果分析

2．1 高压CO2对菌株致死的影响

2．2 流式细胞分析

2．3 激光共聚焦分析

2．4 膜蛋白电泳分析

2．5 扫描电镜结果

2．6 总细胞核酸浓度的测定

3 讨论

4 结论

第七章 结论与展望

1 结论

2 创新点

3 展望

参考文献

研究生期间科研成果

致谢