马铃薯疮痂病的分离和检测体系构建

摘要

马铃薯是继水稻、小麦和玉米之后的世界第四大粮食作物，也是我国农民增收的重要途径和粮食安全的重要保障。马铃薯疮痂病是链霉菌引起的一种表皮性病害，多发生在北方，近年来，疮痂病在我国一些南方马铃薯产区也频繁发生，严重影响块茎的外观品质。本研究收集了广东和湖北两省的疮痂病块茎，进行了疮痂病的分离鉴定，在此基础上建立了疮痂病的相关检测体系，为疮痂病的防控奠定了基础，主要结果如下:
　　1.收集了广东、湖北两省五个地区的疮痂病块茎102个，观察分析了它们的症状类型，及在培养基上链霉菌的培养特征，孢子链形态，并从湖北襄阳的疮痂症状块茎中分离得到XY-12菌株;
　　2.通过表型和显微观察、16S rDNA测序，初步鉴定襄阳疮痂病分离菌株XY-12为Streptomyces bottropensis，进一步的盆栽接种鉴定表明，该分离菌株在接种浓度1.68×103CFU/mL以上能够导致马铃薯中薯5号产生疮痂病症状;
　　3.在收集Streptomyces scabies、S.acidiscabies、S.bottropensis、S.stelliscabiei、S.europeascabiei五种致病菌的66条txtA基因序列的基础上，设计了txtA的特异PCR引物CS-67s/379a，并对退火温度以及模板、引物浓度进行了优化;通过对田间样品的检测，表明该方法能特异检测疮痂病，能够灵敏的检测到106ng疮痂病菌的DNA;
　　4.进一步基于txtA基因设计了5对RPA引物，经检测效果良好，选取其中的一对引物CS-RPA126s/395a分别进行PCR和RPA分析，RPA能够检测104ng疮痂病DNA，低于PCR的灵敏度10倍，但RPA技术可以不依赖复杂的仪器就实现等温扩增，且与PCR引物CS-67s/379a的检测结果有高度的一致性。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 马铃薯疮痂病简介

1．1．1 马铃薯疮痂病的危害与分布

1．1．2 马铃薯疮痂病的症状及发病原因分析

1．2 马铃薯疮痂病菌致病因子的研究

1．2．1 马铃薯疮痂病菌的致病毒素

1．2．2 马铃薯疮痂病菌毒素合成相关基因

1．3 马铃薯疮痂病原菌的分离鉴定

1．3．1 马铃薯疮痂病原菌的分离

1．3．2 马铃薯疮痂病原菌鉴定

1．3．3 马铃薯疮痂病致病种的多样性

1．4 分子技术与病原菌检测

1．4．1 PCR检测技术检测病原菌

1．4．2 RPA检测技术检测病原菌

1．5 研究的目的和意义

1．6 研究创新点

2 试验材料和方法

2．1 供试材料与培养基

2．1．1 供试材料

2．1．2 供试培养基

2．1．3 药品与试剂

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 马铃薯疮痂病菌的分离与纯化

2．2．2 核酸抽提

2．2．3 马铃薯疮痂病病原菌的鉴定

2．2．4 最低致病浓度的确定

2．2．5 马铃薯疮痂病普通PCR体系建立

2．2．6 马铃薯块茎样品的RPA体系构建

3 结果分析

3．1 广东、湖北省五个地区马铃薯疮痴病的主要症状

3．2 马铃薯疮痂病病原菌的分离

3．2．1 第一次分离培养

3．2．2 第二次分离培养

3．2．3 第三次分离培养

3．2．4 最低致病浓度的确定

3．3 马铃薯块茎样品的普通PCR体系构建

3．3．1 txtA基因序列的收集比对

3．3．2 Touchdown PCR

3．3．3 特异引物的PCR产物测序与比对

3．3．4 体系的优化

3．3．5 特异性检测

3．3．6 灵敏性检测

3．3．7 三种不同感病程度的马铃薯块茎的检测

3．3．8 田间材料的PCR检测

3．4 马铃薯块茎样品的RPA体系构建

3．4．1 txtA基因序列的收集比对

3．4．2 RPA引物的特异性检验

3．4．3 RPA反应的灵敏性检验

3．4．4 田间材料的RPA反应与PCR反应的对比

4 讨论

4．1 马铃薯疮痂病菌的分离

4．2 马铃薯疮痂病的检测

4．3 生防菌的筛选

4．4 展望

参考文献

附录

致谢