黄颡鱼自噬的分子特征及在锌影响脂类代谢中的调控机制

摘要

自噬(autophagy)是细胞通过溶酶体分解途径，降解自身衰老、受损或冗余的细胞器如线粒体和长寿命蛋白质的过程，可以提供能量，参与细胞器的更新以及代谢废物的清除，维持蛋白代谢平衡和细胞内环境稳定，是机体对外界不利环境的一种重要的生存防御保护机制。自噬作为生物体内一种大分子物质分解代谢机制，脂滴也是自噬的降解底物之一，自噬囊泡可以结合、吞噬并降解脂肪滴，从而起到维持胞内脂质代谢平衡的目的。
　　锌是生物体必需且重要的微量矿物营养元素之一。我们课题组之前的研究表明锌可以显著影响鱼类肝脏脂沉积及其代谢，但是相关机制并不清楚。锌对黄颡鱼肝脏脂质代谢的影响过程是否伴随着自噬水平的变化？细胞自噬是否介导了锌对脂沉积及其代谢的调控？具体相关作用分子机制是怎样的？我们接下来的课题主要是基于细胞自噬解析锌调控肝脏脂沉积及其代谢的作用机制。以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)为研究对象，首先克隆得到了细胞自噬发生、发展及其调控有关的一批关键基因的全长cDNA序列，并对获得的基因进行了基本分子特征及其功能分析。探讨了饲料锌和水体锌添加（不同暴露途径）对黄颡鱼肝脏细胞自噬的影响，揭示了锌通过不同途径均可以激活细胞自噬。最后基于Zn2+/Ca2+/CaMKKβ/AMPK信号转导通路深入探究细胞自噬在锌调控肝脏脂沉积及其代谢中的作用机制。主要研究成果如下:
　　1黄颡鱼自噬关键基因的分子特征及其功能初步解析
　　利用RT-PCR与RACE技术，我们首先克隆得到了20个介导黄颡鱼细胞自噬起始、成核、延伸、闭合以及成熟过程的关键基因ULK1A、ULK1B、ATG3、ATG4A、ATG4B、ATG4C、ATG4Da、ATG4Db-1、ATG4Db-2、ATG5、Beclin1、ATG7、MAP1LC3A、MAP1LC3B、ATG9A、ATG9B、ATG13-1、ATG13-2、ATG101、SQSTM1的cDNA全长序列。通过对其cDNA序列以及编码蛋白质序列进行分子生物学基本特征分析，首次发现并鉴定了鱼类所特有的一些基因ATG4Da、ATG4Db、ULK1A和ULK1B。通过测定自噬相关基因mRNA组织表达谱，初步解析它们的生理功能。我们发现克隆得到的所有基因拥有与脊椎动物同源基因相似的氨基酸功能结构域，它们的mRNA在黄颡鱼不同组织均有表达，但是呈现不同的表达谱。氨基酸同源性分析，功能结构域分析以及系统进化树分析结果表明黄颡鱼自噬关键基因在进化中是相当保守的，因此这也为细胞自噬在低等脊椎动物鱼类中的重要作用提供了强有力的证据，并且为深入在鱼类中进一步研究细胞自噬的生理功能及其自噬诱导、发生、发展和调控机制提供了可能性。
　　2饲料和水体锌添加（不同暴露途径）对黄颡鱼肝脏细胞自噬的影响
　　设计实验研究不同暴露途径（饲料锌和水体锌）对黄颡鱼肝脏细胞自噬的影响。饲料锌添加实验中，黄颡鱼分别饲喂8.83（低锌）、19.20（中锌）和146.65（高锌）mg Zn/kg的饲料56d。水体锌暴露实验中，黄颡鱼分别暴露于锌添加量为0（对照）、0.25（低）和0.5（中）mg Zn/L的水体中56d。透射电镜结果发现，饲料和水体锌暴露均显著增加了黄颡鱼肝脏细胞自噬囊泡的数量，证明了锌可以通过不同途径激活细胞自噬。无论是饲料锌还是水体锌暴露均上调了细胞自噬关键基因ULK1A、ULK1B、LC3B、ATG4Da、ATG4Db、ATG3、ATG7、ATG9B以及SQSTM1的mRNA表达水平。研究结果表明这些自噬囊泡起始、延伸以及成熟相关基因可能介导了锌对自噬的调控作用，同时可知自噬关键基因的转录激活在锌激活自噬中发挥重要作用。锌能在活体水平激活细胞自噬，提示我们可以从自噬角度出发进一步深入解析锌发挥众多生理功能的分子机制，包括锌对脂代谢的调控作用。为进一步理解细胞自噬在锌影响的生理反应中的作用机制提供了可能性。
　　3基于Zn2+/Ca2+/CaMKKβ/AMPK信号通路分析细胞自噬在锌调控肝脏脂沉积及其脂代谢中的作用机制研究
　　流行病学研究发现机体锌水平与脂质代谢关系密切。临床实验，动物饲养试验和离体细胞实验均证明了锌能显著影响脂沉积及其代谢。细胞自噬在脂代谢中发挥着重要调控作用。锌是否能够激活自噬而缓解脂肪肝变性以及锌在胞内的确切靶标和作用机理仍需进一步深入研究。应用流式细胞术、激光共聚焦显微术以及透射电镜等技术结合油红O染色、BODIPY493/505脂滴染色以及TG(triglyceride)含量测定等方法，在离体和在体水平检测锌对肝细胞脂质沉积的影响。同时通过免疫印迹、流式细胞术、激光共聚焦显微术以及透射电镜等技术手段结合MDC染色，吖啶橙OA染色，溶酶体探针Lyso-Tracker Red染色，自噬标志蛋白LC3B观察，检测自噬水平。结果显示锌能缓解黄颡鱼肝细胞脂沉积，同时激活了细胞自噬，且呈现剂量依赖效应。为了进一步解析细胞自噬在锌调控肝脏脂沉积及其代谢中的作用机制。原代肝细胞进行锌处理，并结合使用自噬抑制剂3-MA和氯喹，结果显示3-MA或氯喹均能抑制锌激活的脂肪分解，表明细胞自噬介导了锌对肝脏脂代谢的调控。BODIPY493/505染脂滴，溶酶体探针染自噬溶酶体，共定位分析结果显示脂滴是锌激活的自噬的底物之一，电镜结果进一步支持了上述结论。同时发现细胞孵育锌激活自噬的同时，非游离脂肪酸NEFA释放增加，线粒体β氧化上调，脂肪合成受到抑制，进一步从下游代谢角度说明锌激活的自噬是特异性的脂噬。为了进一步研究锌激活自噬促进脂解的分子机制，检测诱导自噬发生的经典信号通路(AMPK通路)。ELISA法测定结果显示锌激活了AMPK通路，同时发现信号通路特异性抑制剂Compound C(AMPK抑制剂)和STO-609（CaMKKβ抑制剂）能够抑制锌激活的自噬和脂解，同时下调脂肪酸β氧化，上调肝细胞脂肪合成能力。利用特异的锌离子荧光探针Newport green dcf,发现锌能显著增加细胞内游离的锌离子含量，细胞内锌离子螯合剂TPEN能够抑制锌激活的自噬和脂解，结果表明自噬的激活以及脂解依赖于细胞内游离的Zn2+。利用特异的钙离子荧光探针FLUO-4，发现锌激活了钙流，且能被TPEN所抑制。以上结果表明Zn2+/Ca2+/CaMKKβ/AMPK通路介导了锌对自噬和脂解的激活。综上所述，实验基于Zn2+/Ca2+/CaMKKβ/AMPK信号通路深入解析了细胞自噬在锌调控肝脏脂肪代谢中的作用机制，拓展了我们对锌调控脂代谢分子机理的认识，为深入了解锌的营养及其生理功能分子生物学基础提供了条件，同时为鱼类脂肪肝病的发生机制和防治研究提供新的思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 细胞自噬的研究进展

1．1 细胞自噬关键基因

1．2 自噬调控信号通路

1．3 自噬与脂质代谢

2 锌对细胞的调控机制研究进展

3 锌对细胞自噬影响的研究进展

4 锌对脂代谢影响的研究进展

4．1 锌对哺乳动物脂代谢的影响

4．2 锌对鱼类脂代谢的影响

5 本研究的目的及意义

第二章 黄颡鱼细胞自噬关键基因的分子特征解析及组织表达

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验鱼的饲养及样品采集

2．2 实验试剂

2．3 细胞自噬关键基因cDNA序列的克隆

2．4 细胞自噬关键基因序列分析

2．5 细胞自噬关键基因的组织表达分析

2．6 统计分析

3 结果与分析

3．1 黄颡鱼细胞自噬关键基因cDNA序列特征

3．2 黄颡鱼细胞自噬关键基因氨基酸序列特征

3．3 黄颡鱼细胞自噬关键基因氨基酸序列系统进化分析

3．4 黄颡鱼细胞自噬关键基因组织分布水平

4 讨论

第三章 饲料和水体锌暴露对黄颡鱼肝脏细胞自噬的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验设计

2．2 样品分析

2．3 统计分析

3 结果与分析

3．1 饲料锌暴露对黄颡鱼肝脏细胞自噬的影响

3．2 水体锌暴露对黄颡鱼肝脏细胞自噬的影响

4 讨论

第四章 细胞自噬在锌调控黄颡鱼肝脏脂代谢中的作用

1 前言

2 材料与方法

2．1 黄颡鱼养殖实验

2．2 黄颡鱼肝脏原代细胞的分离及培养

2．3 细胞酶活力分析

2．4 细胞活力及脂质蓄积分析

2．5 肝脏油红以及脂滴BODIPY 493／503染色

2．6 肝细胞超微结构观察

2．7 肝细胞自噬囊泡荧光染色

2．8 肝细胞游离Zn2+和Ca2+含量测定

2．9 定量PCR

2．10 蛋白质免疫印迹分析

2．11 统计分析

3 结果与分析

3．1 日粮锌添加缓解了黄颡鱼肝脏脂沉积

3．2 锌通过激活肝细胞自噬调控脂肪沉积

3．3 锌通过激活脂噬缓解肝细胞脂肪沉积促进脂肪分解

3．4 锌诱导的自噬和脂解依赖于细胞内游离的Zn2+

3．5 锌通过Ca2+／CaMKKβ／AMPK通路激活自噬和脂解

4 讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢