蔗糖诱导马铃薯(S.tuberosum L.)试管薯形成的转录组分析与关键基因筛选

摘要

马铃薯是世界四大粮食作物之一，随着我国马铃薯主粮化战略的启动，马铃薯在国家粮食安全中的作用也越发显著。马铃薯块茎既是食用器官又是繁殖器官，作为繁殖器官其质量直接影响马铃薯的产量和品质。由于无性繁殖的病毒性退化是影响马铃薯种薯质量的关键，因此，脱毒种薯生产技术研究一直是马铃薯种薯繁殖的重要领域。马铃薯试管薯是由脱毒苗在培养容器中形成的块茎生长发育而来，不仅不带病毒而且不带任何病原菌，因此，试管薯的应用成为近年来马铃薯种薯技术的热点。本实验室长期致力于试管薯发育机理和应用研究，前期已在试管薯形成的生理机制中进行了系统研究，近年又定位了一些与试管薯形成有关的QTL，同时针对光照的影响筛选出一些关键调控基因。但在试管薯诱导形成中，几乎所有的研究均显示需要较高浓度的蔗糖，但有关蔗糖调控试管薯形成的分子机理到目前还不清楚，其研究报道也十分有限。本研究利用本实验室建立的试管薯生产体系，从转录组分析人手，筛选分析高蔗糖浓度影响试管薯形成的差异表达基因，并通过不同基因型之间多种处理的实时定量表达分析，探索蔗糖诱导试管薯形成的关键基因，为解析蔗糖在试管薯形成过程中的作用机理奠定基础。主要研究结果如下:
　　1.三个基因型在不同蔗糖浓度处理下试管薯形成能力的表型评价。研究对来自于同一四倍体杂交组合后代的3个基因型（E20、E26和E109）进行高(8％、10％)低(2％、4％)不同蔗糖浓度培养处理，观察统计其试管薯形成情况。结果显示，在低浓度蔗糖培养条件下，3个基因型均不形成试管薯，而在高浓度蔗糖培养条件下，E26和E109可以形成试管薯，说明高浓度蔗糖对马铃薯试管薯形成具有促进作用，试管薯形成在基因型间存在差异。
　　2.蔗糖诱导试管薯形成相关的转录组分析。转录组测序以对蔗糖敏感基因型E26为材料，蔗糖浓度处理采用高糖为10％和低糖为2％，分别在基础苗培养3周后转入蔗糖和短日照培养，将高、低蔗糖浓度处理0，2，5天的样本，采用高通量测序技术获得全基因组转录本信息。过滤除去低质量的Reads后，各样本获得Clean Reads数量均为1.2×107条左右，在Raw Reads中所占的比例均大于98.3％。将Clean Reads在基因组数据库进行比对、合并相同基因的Reads，然后进行处理间差异表达基因分析，最终得到1194个对高蔗糖浓度处理响应的差异基因。
　　3.差异表达基因的生物信息分析。对获得的差异表达基因进行GO功能注释和KEGG pathway代谢途径分析。结果显示，1194个差异表达基因中，具有GO功能注释的基因有683个，参与了138个生物学过程;具有KEGG注释的共有550个基因，参与了106个代谢通路。证明高浓度蔗糖对马铃薯试管薯形成的调控受到多种代谢途径的网络调控。
　　4.与蔗糖诱导相关的候选基因筛选。根据转录组分析信息，研究进一步采用q-PCR方法，对118个差异表达基因进行了表达分析。分析结果显示，转录测序反应的表达趋势和q-PCR反应的表达量间具有显著相关性（R=0.742*）。118个基因的表达模式可以分为7大类，其中A类基因与目标基因最为相关，其表达在高/低蔗糖浓度间差异明显。根据基因表达模式和表达差异，最终筛选出6个在试管薯形成时对高蔗糖浓度具有显著响应的候选基因。它们是:PGSC0003DMG400004800、PGSC0003DMG400018398、PGSC0003DMG400018399、PGSC0003DMG400018401、PGSC0003DMG400022750和PGSC0003DMG400027338。此外，结合前期QTL定位结果，在控制马铃薯试管薯形成的主效QTL MT05区段中筛选出15个候选基因。这21个候选基因可能参与了蔗糖诱导马铃薯试管薯形成的关键调控步骤。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 马铃薯及其产业概述

1．1．1 马铃薯的起源和分布

1．1．2 马铃薯的种植情况

1．1．3 马铃薯的营养价值

1．1．4 马铃薯的经济价值

1．1．5 马铃薯产业链

1．2．马铃薯块茎的发育

1．2．1 匍匐茎的形成和生长

1．2．2 块茎形成

1．3．马铃薯块茎的发育调控

1．3．1 激素对马铃薯块茎发育的调控

1．3．2 光照对马铃薯块茎发育的调控

1．3．3 温度对马铃薯块茎发育的调控

1．3．4 糖类物质对植物发育的调控

1．3．5 调控马铃薯块茎发育的基因

1．4．高通量测序及其在基因差异表达研究中的应用

1．4．1 高通量测序技术的发展及原理

1．4．2 高通量测序技术在转录组学和基因表达调控研究中的应用

1．4．3 RNA-seq在马铃薯中的应用

1．5 课题提出

第二章 材料和方法

2．1 实验材料和处理

2．1．1 基础苗的培养及繁殖

2．1．2 蔗糖诱导结薯处理

2．2 RNA-seq测序文库制备及测序

2．3 生物信息分析

2．4．1 基因相对表达量计算

2．4．2 基因差异表达分析

2．4．3 差异表达基因GO富集分析

2．4．4 差异表达基因Pathway富集分析

2．4 荧光实时定量PCR分析

第三章 结果与分析

3．1 不同蔗糖浓度对试管薯形成的影响

3．2 总RNA提取和质量检测

3．3 转录组测序信息分析

3．3．1 过滤低质量原始数据

3．3．2 碱基组成分析

3．3．3 与基因组比对分析

3．3．4 Reads在基因上的分布

3．3．5 样本间基因表达概况

3．4 差异基因筛选

3．5 差异基因表达模式分析

3．6 差异表达基因Pathway富集分析

3．7 差异表达基因GO功能注释分析

3．8 差异表达基因的定量分析

3．8．1 内参基因筛选和优化

3．8．2 相关性分析

3．8．3 候选基因生物学功能分析

3．8．4 差异表达基因聚类分析

3．9 候选基因的筛选

3．10 主效QTL中的候选基因

第四章 讨论

研究展望

参考文献

附录

致谢