柑橘花药和小孢子培养创制双单倍体及其分子鉴定

摘要

随着高通量测序技术的飞速发展，纯系以其基因组简单便于分析而备受关注。柑橘作为世界上最重要的水果之一，虽然已获得部分纯系材料，但群体较小且涉及的遗传背景较为相似，因此，扩大柑橘纯系群体的工作任重道远。柑橘广泛存在的珠心胚现象，以及童期长、基因组高度杂合等特点，使其无法通过传统的自交获得纯系。花药培养是创制柑橘纯系群体的首选技术。游离小孢子培养为直观地呈现胚离体再生过程提供可能，同时有效减轻后续筛选鉴定的工作量，该项技术已被应用于多个物种。本实验通过花药培养扩大柑橘纯系群体，并尝试柑橘游离小孢子培养;同时，对前人创制的纯系材料进行细胞学鉴定。主要结果如下:
　　1.对柑橘9个品种进行花药培养，共再生85个胚状体，其中枳32个，墨西哥莱檬24个，早花柠檬23个，早金甜橙3个，暗柳橙、露德红夏橙、红暗柳橙各1个。其中46个胚状体生芽，部分离体嫁接于枳砧，随后移栽至温室，其它仍处于继代过程中。选取部分胚状体提取DNA，通过SSR分子标记鉴定再生胚状体的基因型，表明枳、红暗柳橙、早金甜橙均为杂合体;莱檬及墨西哥莱檬均为纯合体，所有再生植株倍性均为二倍体。花药培养过程中，比较花蕾大小、花期、低温预处理时间对花药培养再生率的影响，发现开花在12月的早花柠檬及1月的莱檬再生率明显高于3月开花的枳，而4月开花的其它6个品种的再生率更低;低温预处理7-8d，其再生率高于其它预处理。
　　2.对10个柑橘品种进行游离小孢子培养，参考前人的培养过程稍加改良，预处理液以0.4mol/L甘露醇为基础设置3种处理，培养基以MCM及BH3为基础进行多种改良，培养密度设置4个梯度。对比多种处理发现，以含1％DMSO的0.4mol/L甘露醇作为预处理液，小孢子细胞更倾向于形成类似胚状体的致密细胞团，但其它处理对小孢子细胞的再生几乎没有影响。该实验中获得的致密细胞团没有继续发育。
　　3.对早金甜橙7个纯系愈伤组织进行染色体制片，获得部分较清晰的染色体图像，发现双单倍体愈伤较单倍体愈伤更易发生染色体加倍，这些不同纯系的染色体图像可以用于后续的纯系细胞学研究。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究背景

1．2 前人研究进展

1．2．1 纯系育种研究概况

1．2．2 单倍体诱导途径

1．2．3 再生后代鉴定

1．2．4 纯系的应用价值

1．3 本研究目的和内容

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 材料处理

2．2．2 提取游离小孢子细胞

2．2．3 制备游离小孢子培养液

2．2．4 胚状体再生及转移

2．2．5 倍性鉴定

2．2．6 DNA提取

2．2．7 PCR扩增

2．2．8 SSR分子标记

2．2．9 纯系愈伤组织染色体制片

3 结果与分析

3．1 花药培养

3．1．1 花药培养再生数据统计

3．1．2 花药培养再生芽嫁接及其倍性鉴定

3．1．3 花药培养再生植株嫁接苗遗传鉴定

3．2 游离小孢子培养

3．3 纯系愈伤组织染色体制片

4 小结与讨论

4．1 花药培养

4．1．1 再生率差异的原因分析

4．1．2 再生胚状体分子标记结果的复杂性

4．2 不同处理对游离小孢子培养结果的影响

4．3 纯系愈伤倍性变化的比较

参考文献

附录

致谢