稻曲病菌侵染特性及产孢相关基因UvPRO1的功能分析

摘要

稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）引起的稻曲病是危害水稻生产的重要病害，其产生的稻曲毒素也极大地威胁粮食安全。本研究在组织学水平对稻曲菌在抗、感品种上的侵染差异进行了观察，研究了稻曲病菌的侵入时期及其侵染过程，利用ATMT方法构建了高效的稻曲病菌突变体库，从中筛选出产孢相关突变体，并对产孢相关基因UvPRO1进行了功能分析。研究的主要结果如下:
　　1.用GFP荧光标记的稻曲菌分生孢子分别在孕穗期（幼穗分化7-8期）接种抗病品种IR28和感病品种晚籼98，在体式荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察稻益菌在两个品种穗部的侵染过程。结果表明，接种后6、12、24、48和72h，分生孢子在抗、感病品种颖壳表面的萌发率分别为11.4％、38.1％、42.5％、56.7％、57.2％和12.7％、36.5％、46.3％、73.4％、75.7％，在接种48h后稻曲菌在抗病品种颖壳上的萌发率显著低于感病品种。接种感病品种后3-15d，菌丝首先在颖壳外表面延伸扩展，随后通过颖壳内外稃之间的缝隙扩展至颖壳内侧，并在雄蕊和雌蕊表面定殖，逐步侵染花丝、花药、花柱和柱头，并将整个花器包裹在致密的菌丝内，菌丝团进一步膨大，从内外稃之间挤出，形成稻曲球。而在抗病品种上，稻曲菌的侵染过程与感病品种基本一致，但稻曲菌菌丝侵入到抗病品种颖壳内侧的比例比感病品种下降了86.9％-92.3％，菌丝侵染抗病品种颖花花柱和柱头的时间均比感病品种推迟了3d，并且对花柱和柱头的侵染比例下降了92.2％-95.3％和92.5％-95.7％。在接种15d后，抗病品种和感病品种的穗发病率分别为7.5％和89.1％，每穗病粒数分别为4.6和31.7。上述结果表明抗性品种颖壳表面分生孢子的萌发及菌丝从颖壳外表面侵入颖壳内侧受到抑制，推迟了菌丝侵染花器的时间和侵染比例，减少了在水稻授粉前侵染颖花的几率，导致穗发病率和病粒数显著降低。
　　2.选用GFP荧光标记的稻曲菌分生孢子分别接种芽期、分蘖期、孕穗期和扬花期的水稻植株，观察接种后的侵染过程，并利用GFP引物检测接种后不同生育期植株不同组织的带菌率。研究结果表明:(1)芽期浸根接种后1-3d，稻曲菌分生孢子能附着在胚根和根毛的表面萌发形成菌丝，从根毛基部或侧根生长点的细胞间隙侵入胚根表皮。接种5d后，菌丝在侧根生长点和胚根表皮组织内大量繁殖扩展，并向上扩展至胚芽鞘。接种7d后，在芽鞘和不完全叶表面有少量菌丝定殖。在接种后30d（水稻生长至分蘖期）和接种后90d（水稻生长至孕穗期）的极少数稻株的叶鞘表面观察到有绿色荧光菌丝的存在。用PCR方法在接种后分蘖期至蜡熟期水稻植株的根、茎、叶以及孕穗期至蜡熟期的稻穗上均检测到稻曲菌的存在。(2)分蘖期注射接种后1-7d，附着在叶鞘和茎表面的分生孢子萌发形成菌丝，并向四周扩展繁殖。但用PCR的方法，在孕穗期至蜡熟期的穗、叶和茎中均未检测到稻曲菌的存在。(3)孕穗期喷雾接种后1-3d，分生孢予萌发形成的菌丝在剑叶的叶鞘表面扩展繁殖，形成菌丝团。接种后5-12d，在颖花颖壳上、雄蕊和雌蕊表面均未观察到稻曲菌存在。但用PCR的方法在扬花期和蜡熟期的穗和叶部检测到稻曲菌的存在。而孕穗期注射接种后5-12d，菌丝能通过内外稃之间的缝隙侵入颖壳内表面，侵染花丝、花药、柱头和花柱，最终形成稻曲球，发病率为93.3％，平均每穗31.4个稻曲球。用PCR方法在扬花期和蜡熟期的穗、叶和茎部均检测到稻曲菌的存在。用Real-time PCR方法检测了孕穗期注射接种15d后三种灌浆相关基因（OsPromln2、OsRISBZ1和OsGlutln1）在颖花中的相对表达量，三种灌浆相关基因在被侵染形成稻曲球的颖花中的相对表达量比被侵染未形成稻曲球的颖花分别上调13.2倍、43.5倍和28.6倍，表明灌浆基因的激活表达可能是稻曲球形成的关键因子。(4)扬花期喷雾接种后1-12d，分生孢子在颖壳外表面萌发形成的菌丝，菌丝扩展至颖壳内表面和子房基部，但未观察到菌丝侵染花丝、花药、柱头、花柱和子房，而用PCR的方法在蜡熟期的穗部检测到病原菌的存在。
　　上述研究结果表明:稻曲病菌分生孢子能够在根、茎、叶、颖花等植物组织上萌发产生菌丝，并向四周扩展繁殖，但不同接种方法观察到菌丝扩展距离不一致。除分蘖期接种外，都可以用PCR方法在接种植株生育后期的不同组织检测到稻曲菌存在。芽期接种后，稻曲菌侵染胚根，并可扩展到胚芽鞘、芽鞘、不完全叶乃至地上部的叶鞘。孕穗期注射接种后，观察到稻曲菌从侵染到稻曲球形成的直接证据，表明稻曲球的形成与稻曲病菌能否在颖花受精之前完成对花柱和柱头的侵染密切相关。一旦颖花受精完成，病原菌即使扩展至颖花内部，因无法吸收营养，也不能形成稻曲球，稻曲菌不能引起扬花期颖花发病。
　　3.建立了高效的农杆菌介导的稻曲病菌的转化体系。该体系中稻曲菌孢子浓度为105个孢子/mL，共培养温度为24℃，共培养时间为4d，AS浓度为200μmol/L，转化子筛选的潮霉素浓度为200μg/mL，转化效率为232.5个转化子/105个孢子。通过该体系获得了3016个具有稳定潮霉素抗性的转化子，筛选到5个产孢相关的突变体T-133、T-420、T-896、T-1296、T2328，采用Inverse-PCR和Tail-PCR的方法扩增并对T-DNA侧翼序列进行了分析，结果表明突变体T-420和T-1296的T-DNA插入破坏的基因均与真菌中的假定蛋白有较低的同源性，其功能尚未见报道。突变体T-133的T-DNA插入破坏的基因与绿僵菌中的转录调控蛋白PRO1同源。突变体T-896的T-DNA插入破坏的基因与绿僵菌中丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶同源。突变体T-2328的T-DNA插入破坏的基因与镰刀菌中多糖合成酶同源。
　　4.对T-133突变体的产孢相关基因UvPRO1的功能进行了分析，结果表明，在PSA平板上生长6d后，敲除转化子△UvPRO1-27的菌丝生长平均速度为2.20mm/d，显著低于互补转化子C△UvPRO1-27(2.76m m/d)和野生型菌株(2.73mm/d);在PS液体培养基中，野生型菌株和互补转化子在培养7d后产生大量分生孢子，分生孢子量分别为6.72×106个/mL和6.82×106个/mL，而敲除转化子△UvPRO1-27未观察到有分生孢子形成;在抗逆性方面，分别用不同浓度的NaCl(0.1-0.5mol/L)、SDS（0.01-0.05％）和CR（30-70μg/mL）测定了盐胁迫压力、细胞膜和细胞壁压力对敲除转化子的影响，结果表明敲除转化子△UvPRO1-27在各种压力条件下，均表现出比野生型菌株和互补转化子更高的敏感性;孕穗期（幼穗分化7-8期）注射接种后1-3d，敲除转化子△UvPRO1-27菌丝在水稻颖壳外表面延伸扩展。接种4d后，在颖壳外表面的菌丝扩展受到抑制，直至接种12d后，仍然未观察到菌丝扩展至颖花内侧，在颖壳内表面、雄蕊和雌蕊上均未观察到有病菌存在。而野生型菌株和互补转化子接种后，菌丝能够从颖壳外表面扩展至颖壳内表面，侵染颖花花器并形成稻曲球。上述结果表明，UvPRO1基因对稻曲菌菌丝生长、产孢、抗逆性和致病力方面都具有显著的调控作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 稻曲病的发生及危害

2．1 稻曲病病原

3 稻曲菌的侵染特性

3．1 田间初侵染源

3．2 侵染时期及侵染过程

4 水稻对稻曲病的抗性机制

5 稻曲菌基因组学研究

6 水稻与稻曲菌之间的互作机制

7 稻曲菌的遗传转化及功能基因研究

7．1 稻曲菌的遗传转化

7．2 稻曲菌功能基因的克隆

8 真菌中PRO1基因的功能研究

9 本研究的目的和意义

第二章 稻曲病菌对不同抗性水稻品种的穗部侵染研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 GFP标记菌株的获得

3．2 稻曲病菌对感病品种幼穗的侵染过程

3．3 稻曲菌对抗病品种幼穗的侵染过程

3．4 抗、感水稻品种颖花各组织的侵染率及发病情况比较

4 讨论

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 水稻芽期接种后稻曲菌对植株的侵染观察

3．2 水稻分蘖期接种后稻曲菌的侵染观察及带菌率检测

3．3 水稻孕穗期接种后稻曲菌的侵染观察及带菌率检测

3．4 水稻扬花期喷雾接种后稻曲菌的侵染观察及带菌率检测

3．5 不同接种时期对稻曲病发生的影响

4 讨论

第四章 稻曲菌T-DNA插入突变体库构建、产孢相关突变体筛选及侧翼序列分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 筛选转化子所需潮霉素B浓度的确定

3．2 头孢霉素对农杆菌生长的抑制作用

3．3 共培养时间和共培养温度对转化效率的影响

3．4 转化过程中AS浓度对转化效率的影响

3．5 共培养的农杆菌浓度和分生孢子量对转化效率的影响

3．6 稻曲病菌T-DNA插入突变体库的构建及质量分析

3．7 稻曲病菌产孢相关突变体的筛选

3．8 产孢相关突变体的Southern杂交检测

3．9 产孢相关突变体的T-DNA侧翼序列扩增

3．10 产孢相关突变体的T-DNA侧翼序列分析

4 讨论

第五章 稻曲菌产孢相关基因UvPRO1的功能分析

1 前言

2 材料与方法

2．1 材料

2．2 方法

3 结果与分析

3．1 稻曲菌UvPRO1基因的序列分析

3．2 稻曲菌UvPRO1基因敲除转化子的获得及PCR验证

3．3 敲除转化子的Southern杂交验证

3．5 UvPRO1基因敲除转化子与互补转化子的RT-PCR验证

3．6 UvPRO1基因敲除转化子和互补转化子的生物学性状观察

3．7 不同压力胁迫对UvPRO1基因敲除和互补转化子的影响

3．8 UvPRO1基因敲除转化子和互补转化子的致病力测定

3．9 UvPRO1基因敲除转化子和互补转化子的侵染过程观察

3．10 稻曲菌UvPRO1基因表达动态分析

4 讨论

1 全文总结

2 创新性

3 展望

参考文献

附录

致谢