青鱼nanog和oct4基因的鉴定及青鳉肌肉细胞系的建立

摘要

作为“四大家鱼”之首，青鱼（Mylopharyngodon piceus）是我国主要的养殖品种之一，具有重要的经济价值和科研意义。目前，有关青鱼的研究主要集中在人工养殖、营养与饲料和疾病防控等方向而缺乏分子水平上的一些基础研究数据。诱导多功能干细胞(iPS)是一类具有无限自我更新能力且能在特定条件下定向分化的细胞，Nanog和Oct4基因是哺乳动物中维持胚胎干细胞多能性以及自我更新能力的关键性基因，也是成功诱导多功能干细胞的关键因子。为了成功诱导鱼类iPS，本研究分离和鉴定了青鱼nanog和oct4基因及nanog上游启动子序列，初步分析了它们的基因结构、在不同成体组织和早期胚胎发育中的表达模式，证明了它们的表达模式有别于哺乳动物，具有母源性表达特征。此外，本研究还建立了青鳉肌肉细胞系(OLM)，分析和鉴定了它的基本生物学特征，并且通过荧光素酶实验测定了不同区段nanog启动子在OLM中的活性。其主要研究结果如下:
　　1)Mpnanog基因组DNA(genomic DNA，gDNA)全长3295bp，cDNA全长1550bp，包括4个外显子，预计编码具有390个氨基酸残基的蛋白;多物种蛋白序列比对结果显示MpNanog具有一个Nanog蛋白保守的含有63个氨基酸残基的同源结构域，其中，MpNanog与团头鲂Nanog蛋白相似程度最高，可达到95％;进化树结果显示MpNanog与硬骨鱼类聚为同一分支。
　　2)RT-PCR结果显示Mpnanog特异性表达于卵巢中以及早期胚胎发育过程，从未受精卵到囊胚期一直持续高表达，原肠胚期表达迅速下降;切片原位杂交结果进一步显示Mpnanog的转录本表达于卵子发育过程中的卵原细胞（Ⅰ期）和初级卵母细胞(Ⅱ期);同时，整胚原位杂交结果显示Mpnanog转录本的信号均匀的分布在早期胚胎发育的卵裂球中。
　　3)通过TAIL-PCR技术克隆得到了长约1.8kb的Mpnanog上游5'转录调控序列，构建了Mpnanog不同区段启动子的双色荧光质粒psi-CHECK-2-Mpnanog-1775、1070、550，并检测了它在2种转基因青鳉肌肉细胞系中均具有较高的活性。
　　4)Mpoct4cDNA全长共3412bp，预测编码472个氨基酸;多物种蛋白序列比对显示MpOct4同样具有OCT4蛋白保守的POUs和POUHD亚结构域，与已报道的团头鲂Oct4相似度最高，约为98.31％;进化树结果显示MpOct4与硬骨鱼类聚为同一分支。
　　5)RT-PCR结果显示Mpoct4特异性表达于卵巢中以及早期胚胎发育过程，从未受精卵到原肠胚期一直持续高表达，胚胎后期表达量锐减;切片原位杂交结果进一步显示Mpoct4转录本表达于卵子发育过程中的卵原细胞（Ⅰ期）和初级卵母细胞（Ⅱ期）;同时，整胚原位杂交结果显示Mpoct4转录本的信号分布于早期胚胎发育的卵裂球中。
　　6)建立了青鳉肌肉细胞系，并对其冻存复苏能力、生长曲线、细胞来源和染色体核型等基本生物学特性进行了描述，然后对该细胞的脂质体转染效率进行了测定。一系列结果显示，OLM细胞系确实来源于青鳉，染色体众数为48，生长曲线呈“S”型以及该细胞系的转染效率约为40％。
　　综上所述，我们首先分离和鉴定了青鱼中与哺乳动物干细胞主控基因Nanog和oct4同源的Mpnanog和Mpoct4基因，证明了它们的母源性表达特征;同时建立了1种能高效转染的青鳉肌肉细胞系，并且测试了Mpnanog启动子在其中的活性，为接下来鱼类iPS的研究奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 Nanog基因的研究进展

1．1．1 Nanog基因的发现

1．1．2 Nanog基因的分子结构

1．1．3 Nanog基因的表达模式

1．1．4 Nanog基因的功能

1．1．5 Nanog基因的表达调控

1．2 本研究的主要内容、目的和意义

第二章 青鱼nanog基因的克隆、表达模式分析

2．1．引言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 主要试剂和仪器

2．2．3 实验方法

2．2．4 DNA提取和序列克隆

2．2．5．基因序列比对与分析

2．2．6 半定量RT-PCR

2．2．7 原位杂交

2．2．8 交错式热不对称PCR(Tail-PCR)

2．2．9 双荧光素酶质粒构建与鉴定

2．2．10 双荧光素酶质粒活性检测

2．3 结果

2．3．1 青鱼nanog基因克隆及序列分析

2．3．2 多物种Nanog氨基酸序列比对及系统进化树的构建

2．3．3 青鱼nanog基因半定量RT-PCR分析结果

2．3．4 青鱼nanog基因原位杂交分析结果

2．3．5 青鱼nanog基因启动子区序列的获得

2．3．6 青鱼nanog基因启动子生物信息学分析

2．3．7 青鱼nanog基因启动子不同区段荧光素酶报告系统活性检测

2．4 讨论

第三章 青鱼oct4基因的克隆、表达模式分析

3．1 引言

3．2 Oct4基因的研究进展

3．3 材料和方法

3．3．1 实验材料

3．3．2 主要试剂和仪器

3．3．3 实验方法

3．3．4 半定量RT-PCR

3．3．5 原位杂交

3．4 结果

3．4．1 青鱼oct4基因克隆及序列分析

3．4．2 多物种Oct4蛋白序列比对及系统进化树的构建

3．4．3 青鱼oct4基因半定量RT-PCR分析结果

3．4．4 青鱼oct4基因原位杂交分析结果

3．5 讨论

第四章 青鲔肌肉细胞系的建立

4．1 引言

4．2 鱼类细胞培养技术进展

4．3 材料和方法

4．3．1 主要试剂和仪器

4．3．2 实验方法

4．4 结果

4．4．1 青鲔肌肉细胞的原代培养

4．4．2 青鳝肌肉细胞的传代培养

4．4．3 细胞的冻存和复苏能力

4．4．4 细胞的核型分析

4．4．5 细胞生长曲线的测定

4．4．6 细胞的来源鉴定

4．4．7 细胞的脂质体转染效率分析

4．4．8 转基因细胞系的获得

4．5 讨论

参考文献

6 附录

致谢