重组人酸性成纤维细胞生长因子促进微波灼伤创面修复的实验研究

摘要

慢性宫颈炎是妇科常见病、多发病，约60％左右已婚妇女罹患有不同程度的慢性宫颈炎，主要表现为宫颈糜烂。肉眼观，宫颈外口处的宫颈阴道部外观呈颗粒状红色区，易接触性出血，子宫颈糜烂的愈合过程是在炎症病变减弱的情况下，邻近的鳞状上皮向覆盖糜烂面的柱状上皮下生长，逐渐向腺上皮推移，最后完全被鳞状上皮覆盖而痊愈。但由于种种原因，宫颈糜烂发生后很难自愈，其治疗以物理疗法为主，主要通过冷、热等各种物理手段(激光、冷冻、红外线凝结及微波等)，将宫颈糜烂面单层柱状上皮破坏，使其坏死脱落后，为新生的复层鳞状上皮覆盖。物理疗法治疗宫颈糜烂的疗效是肯定的，但存在术后阴道长时间分沁物增多，甚至有大量水样排液及脱痂时出血，创面愈合时间长，且在创面尚未愈合期间(4～8周)需禁性生活等缺点，因此许多慢性宫颈炎患者不愿接受物理疗法的治疗。如何使物理手段这一高效治疗宫颈糜烂的方法让众多宫颈糜烂患者接受呢?最好的方法是加速物理疗法所致创面的修复，缩短创面愈合时间，减轻其副反应如术后阴道长时间排液及脱痂时出血等。 创伤修复是医学领域中最古老的问题之一，自从20世纪80年代开展生长因子在创伤修复中作用的研究以来，创伤修复这个古老的医学课题由此进入了一个阶段：随着分子生物学和生物工程等高新技术的进步和发展，以及它们在这一领域的应用，使创伤修复成为了集医学、生物化学以及生物材料学等诸多专业与学科为一体的边缘性学科。 近年研究认为伤口的愈合受多种细胞生长因子(PDGF、VEGF、FGF、EGF、TGF-α、IGF-1等)的调节和影响，其中成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)是目前研究最多、最深入、应用最广泛的生长因子之一，已发现成纤维细胞生长因子家族中至少有30个成员。酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibroblastgrouthfactor，aFGF，FGF1)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF，FGF2)是最先被发现的两个成员，因各自氨基酸残基的等电点为酸性和碱性而得名。aFGF和bFGF都是154个氨基酸的蛋白质，氨基酸顺序同源性达55％，有相似的生物学功能，且通过相同受体而发挥作用。现代医学研究发现，酸性成纤维细胞生长因子是体内一种正常微量的物质，在人体组织内分布极为广泛，起着调节细胞DNA合成、促进细胞分裂和刺激血管生成的作用，对皮肤受伤后的快速修复起着十分重要的作用。正常情况下，aFGF含量很低，伤口的自身修复是一个缓慢的过程。 成纤维细胞生长因子主要对中胚层和神经外胚层来源的多种细胞如上皮细胞、内皮细胞、肌细胞、成纤维细胞等有营养和分化作用。大量基础及临床研究表明，bFGF通过促进细胞分裂、增殖、趋化作用，从而促进烧创伤、溃疡等的修复与愈合。另外，bFGF能够促进损伤血管的修复和生长。国外也有部分关于aFGF促进创伤修复的报道，对创伤、糖尿病溃疡等多种皮肤损伤都有良好的促愈合使用。宫颈系由中胚层的间介中胚层分化而来，富含FGF的受体(FGFR)，理论上当慢性宫颈炎接受物理治疗形成创面时，给予外源性aFGF，外源性aFGFGF与FGFR结合发挥促进损伤血管的修复和新生血管的生长及促细胞增殖作用，从而促进创面的修复，缩短创面愈合时间，减少术后阴道排液及脱痂时出血等不适，但尚须进一步临床试验验证。 酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)临床应用是目前生物医学界研究最活跃的领域之一。我国有的公司利用基因工程技术，已将人酸性成纤维细胞生长因子(haFGF)基因重组进大肠杆菌质粒中，获得了高效表达生物活性产物的工程菌株，其化学结构、理化性质和生物活性与天然haFGF完全一致。本课题旨在应用重组人酸性成纤维细胞生长因子，进行有关动物微波灼创伤愈合实验研究，为其在慢性宫颈炎物理治疗所致创面的修复中的应用，提供参考。 本实验拟研究：1.aFGF基因和蛋白在家兔微波灼伤创面皮肤组织中的表达。2.微波灼伤创面应用rhaFGF后皮肤组织细胞DNA含量分析。3.观察rhaFGF对家兔微波灼伤创面的促修复作用。4.观察rhaFGF对小型猪微波灼伤创面的促修复作用。5.皮肤过敏试验。6.皮肤急性毒性试验。7.rhaFGF对家兔烧伤局部用药后的药代动力学研究。8.rhaFGF在家兔体内的分布和排泄。 方法1.建立家兔微波灼伤创面模型，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学方法（ABCS)，分别于伤后12、24、48、96h检测aFGF基因及2、4、8、12d检测aFGF蛋白在损伤组织中表达变化，从基因水平阐明了aFGF参与了创伤修复过程。2.、建立家兔微波灼伤创面模型，于伤后第3、7、14d取创面全层皮肤组织，经胰酶消化得表皮细胞悬浮液，采用流式细胞仪，测试皮肤组织细胞中DNA的含量及细胞周期，从细胞水平进一步阐明aFGF促进创伤修复的机制。3.建立家兔微波灼伤创面，分别用不同剂量的rhaFGF作为治疗组，以bFGF为阳性对照组，溶媒作为阴性对照组，采用创面照像，透明膜描记称量法记录伤后3、14、21d创面面积；伤后14、21d取创面组织，经4％多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切片，HE染色，观察创面肉芽组织生长与再上皮化，评价修复效果。4.建立小型猪微波灼伤模型，分别用不同剂量的rhaFGF作为治疗组，以bFGF为阳性对照组，溶媒作为阴性对照组，采用创面照像，透明膜描记称量法记录伤后第3、7、14d创面面积；伤后7、14d取创面组织，经4％多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切片，HE染色，观察创面肉芽组织生长与再上皮化，评价修复效果。5.采用动物皮肤过敏试验方法，将豚鼠分为rhaFGF组、溶剂对照组、阳性对照组，当动物初始接触受试品二周后，再进行受试品的激发接触，观察是否已导致过敏状态。6.采用急性毒性试验方法，将受试大鼠分完整皮肤组和破损皮肤组，局部涂抹高剂量rhaFGF，观察全身中毒反应，测定半数致死量(LD50)。7.采用放射性同位素(125I)示踪技术结合三氯醋酸(TCA)沉淀的方法，观察家兔皮肤烧灼伤创面用药后血浆或血清总放射性，TCA可沉淀放射性125I-aFGF浓度一时间变化图形和有关的药代动力学参数，比较面积或剂量对全身吸收的影响。8.采用放射性同位素(125I)示踪技术结合TCA沉淀技术，研究家兔单剂量静脉注射125I-rhaFGF后该物质在体内主要器官的分布和排泄途径，了解局部用药时吸收至血液内的原形药物的分布特点。 结果:1.观察到创伤后12haFGF基因表达开始增加，24haFGF基因表达明显增加，48haFGF基因表达最强，96haFGF基因表达减弱。2.应用rhaFGF后，灼伤创面全层皮肤组织细胞DNA含量增加、G1期细胞不断进入S期、S期及G2+M期细胞数较生理盐水组明显增加。3.家兔及小型猪微波灼伤后第14、21d，rhaFGF高剂量治疗组创面较溶媒、空白对照组明显收缩变小，再上皮化完整。4.将rhaFGF(1500U/cm2)涂抹于豚鼠背部皮肤，未见豚鼠背部给药区皮肤出现红斑和水肿，致敏率均为0.0％。5.将rhaFGF(12mg/kg)涂抹于大鼠完整皮肤及破损皮肤，未见明显的全身中毒反应，无动物死亡。rhaFGF皮肤给药的LD50大于12mg/kg。6.rhaFGF对家兔皮肤烧伤创面局部用药后的药代动力学研究表明，家兔烧伤创面给药后全身吸收很少，而且第五次给药后的血清总放射性和TCA沉淀部分放射性浓度的绝对生物利用度分别为3.1±1.8％和11.2±7.5％，与第一次给药的生物利用度3.2±1.5％和6.2±2.6％相比差别无显著性(P＞0.05)。7.家兔静脉注射125I-rhaFGF后不同时间总放射性的分布，按血药浓度-时间曲线下面积(AUC)排序由大到小依次为：骨髓/股骨、肝、肾、脾、肾上腺、空肠、尿、胆囊、肠容物、肠淋巴结、肺脏、脂肪、心脏、血清、膀胱、胸腺、卵巢、睾丸、肌肉、脑。家兔静脉注射125I-rhaFGF后主要经尿排泄，少量经粪排泄。 结论:1.在整个愈合过程中，内源性的aFGF均有明显的表达，表明aFGF参与了创面的修复过程。2.rhaFGF具有促进微波灼伤创面组织细胞增殖，加快创面愈合的作用。3.haFGF通过促进肉芽组织生长，血管形成与再上皮化作用，加速小型猪、兔烫伤的创面修复，这种作用与剂量有关，较高的剂量促进愈合作用更明显。4.微波烧灼伤创面应用rhaFGF治疗是安全的。5.上述实验结果表明：一定剂量的rhaFGF对动物的微波灼伤创面修复是有效的、安全的，但对宫颈糜烂物理疗法所致创面的修复效果如何，尚待进一步临床试验证实。

目录

前言

第一部分rhaFGF菌种构建、分离纯化及活性鉴定

第二部分

实验一aFGF在创面皮肤组织中的表达

实验二微波灼伤创面应用生长因子后的DNA含量分析

第三部分

实验一rhaFGF对家兔微波灼伤创面的修复作用

实验二rhaFGF对小型猪微波灼伤创面修复的作用观察

第四部分

实验一rhaFGF的皮肤过敏试验

实验二rhaFGF的皮肤毒性试验

第五部分

实验一rhaFGF兔烧伤局部用药后的药代动学研究

实验二125I-rhaFGF在家兔体内的分布和排泄

讨 论

结 论

参考文献

综 述成纤维细胞生长因子的研究及应用

读博期间发表文章及成果

致谢

附录