大鼠部分肝移植肝动脉化模型的建立及小移植物早期损伤机制的初步研究

摘要

第一部分大鼠部分肝移植肝动脉化模型的研究　　目的：建立大鼠部分肝移植的肝动脉重建动物模型，并研究肝动脉重建对大鼠部分肝移植后肝功能、肝再生的意义。 方法：SD大鼠行切除左外叶和乳头叶的原位部分二袖套法肝移植，分为未行肝动脉重建(POLT组，n=24)和肝动脉重建(APOLT组，n=24)，分别于术后第1、2、4和7天处死后查肝功能、组织学检查及流式细胞仪检测移植肝增殖活性。 结果：肝功能检查ALT和TB值术后第1天2组即开始明显增高，以后逐渐降低，第4天ALT和TB值POLT组均高于APOLT组，差异有显著性(P＜0.05)；组织学检查术后APOLT组与POLT组相比可见更多的二倍体和多倍体肝细胞(P＜0.05)；第2天和第4天APOLT组增殖指数分别为33.81±3.45％和35.33±2.52％较POLT组23.08±4.66％和29.79±1.81％明显增高，差异有显著性(P＜0.01)。 结论：本研究结果初步表明肝动脉吻合可明显改善大鼠部分肝移植移植肝的功能，减轻移植肝的组织学改变，促进部分移植肝的再生。 第二部分大鼠部分肝移植模型早期损伤机制的研究 目的：建立大鼠部分肝移植肝动脉化模型的基础上，以全肝移植模型和不吻合肝动脉的部分肝移植模型为对照，对部分肝移植后移植物早期损伤的机制以及肝动脉化在小移植物损伤中的地位和作用进行初步研究。 方法：选取雄性SD大鼠，随机分成4组：①假手术组(A组)；②全肝移植组(B组)；③部分肝移植肝动脉化模型组(C组)；④部分肝移植组(D组)。在恢复血供后30min，2h，3h，6h，12h，24h等6个时间点分别取材、送检。主要检测指标：1、肝功能指标检测。2、肝组织病理组织学检查和透射电镜检查。3、检测血清标本TNF-α的表达。4、检测肝组织标本NF-KappaB亚基(P55和P65蛋白)的表达。5、原位末端标记法(TUNEL)检测凋亡。6、荧光半定量RT-PCR检测ICAM-1、TNF-α和TNF-α受体在肝组织中的表达。7、提取核蛋白，采用电泳迁移率改变法测定NF-κB的结合活性。8、所有数据采用均数±标准差(M±SD)表示，用SPSS软件包(11.5版)进行统计学处理，均数的比较采用t检验，率的比较采用x2检验。组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK法。 结果：1、肝功能：A组(假手术组)TB、ALT和AST值显著低于其余3组(P＜O.05)；TB、ALT和AST峰值均出现在术后6h和12h后逐渐下降；TB、ALT和AST峰值依次为D组＞C组＞B组(P均＜0.05)。2、B、C和D3组均可见到典型移植肝缺血再灌注损伤改变。其中以6h时间点损伤最重，24h时间点组织水肿、肝窦充血已经明显减轻。电镜见B、C、D组细胞肿胀破坏明显，线粒体嵴断裂、消失，染色质边集明显或者核溶解消失，可见到典型的凋亡肝细胞。3、再灌注后B、C和D组肝组织P50蛋白和P65蛋白表达显著升高，在2h和3h时达到峰值，随后明显下降；至12h～24h，P50接近对照组水平，而P65仍显著高于对照组。峰值D组＞C组＞B组，其中D组峰值显著高于B组和C组，而B、C组峰值没有显著差异。P50和P65在24h，6个时间点的血清水平变化趋势相似，P65维持时间较P50长。4、再灌注后B、C和D组血清TNF-α表达水平显著升高，在3h时达到峰值，随后逐渐下降；至12h～24h，仍维持远高于对照组的水平。峰值D组＞C组＞B组，其中D组峰值显著高于B和C组，而B、C组峰值没有显著差异。5、D组(部分肝移植组)各时间点细胞凋亡数均显著多于B组(全肝移植组)和C组(部分肝移植肝动脉化组)。B组和C组相比也有显著性差异。各组细胞凋亡以术后6h最重。6、对照组(A组)为阴性表达；TNF-α扩增片段长241bp，-actin扩增片段长为331bp。D组峰值位于2h，B、C组峰值位于3h，但与2h点mRNA水平接近；6h后显著下降，B、C组12h和24h为阴性表达，D组12h表达显著减少，24h点为阴性表达。ICAM-1基因产物长度为570bp，TNF-α受体2基因产物长度为240bp。对照组(A组)为阴性表达，在B、C、D组均检出目的基因扩增产物阳性表达，D组表达水平显著高于B、C组。7、A组肝组织中NF-KappaB的活性很弱，呈阴性表现。B、C、D三组NF-KappaB变化趋势相仿，一般在恢复灌注后即活化，0.5h时间点开始检出；峰值出现在2h和3h，至6h已明显消退；D组的活化峰值强度高于B、C组，NF-KappaB活化维持时间较B、C组明显延长，至12h仍可以检出。 结论：1、不吻合肝动脉的大鼠部分肝移植模型的小移植物在移植术后早期存在比全肝移植、吻合肝动脉的部分肝移植模型的移植物更为严重的缺血再灌注损伤。这种损伤以肝细胞功能改变及大量肝细胞凋亡为特点。 3、NF-κB、TNF-α、ICAM-1的表达强度与肝脏损伤程度有密切关系，可能是移植物损伤的主要分子机制。移植肝内NF-κB的高表达可能是移植肝缺血再灌注损伤发生的重要始动环节之一。移植肝发生缺血再灌注损伤，胞浆内I-kappaB降解，NF-kappaB游离并进入细胞核内，与一些炎症因子基因启动子区域特异性序列结合，上调TNFα、ICAM-1mRNA表达，从而引起肝脏缺血再灌注损伤。这可能揭示了NF-kappaB/I-kappaB传导通路在肝脏缺血再灌注损伤中的作用机制。 第三部分iNOS在大鼠部分肝移植早期损伤中的表达及意义 目的：建立大鼠部分肝移植模型，对诱导性一氧化氮合成酶(iNOS)在大鼠肝移植小移植物早期损伤中的表达及意义进行研究。 方法：选取雄性SD大鼠，随机分成3组：假手术组(正常对照组，A组)；缺血再灌注损伤组(B组)；小移植物组(C组)。比较各组肝功能指标变化、肝脏脂质过氧化产物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的浓度、肝脏组织病理组织学和透射电镜改变、RT-PCR检测iNOS在肝组织中的表达。 结果：A组肝功能指标显著低于其余2组；肝功能指标峰值均出现在术后6h，12h后逐渐下降；肝功能指标峰值依次为C组＞B组＞A组(P＜0.05)。A组MDA显著低于其余2组，肝脏MDA浓度C组＞B组＞A组(P＜0.05)SOD呈相反变化。光镜检查、电镜检查B、C两组均可见到肝脏再灌注损伤后典型的病理变化。再灌注后B、C组肝组织中iNOS表达水平显著升高，在6h时达到峰值，随后逐渐下降；至12和24h仍维持远高于对照组的水平。C组iNOS峰值组显著高于B组。 结论：iNOS在小移植物损伤中积极地参与了缺血再灌注损伤过程，自由基在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。

目录

缩略词

第一部分大鼠部分肝移植肝动脉化模型的建立

研究背景

材料和方法

结果

讨论

小结

图

参考文献

第二部分大鼠部分肝移植模型早期损伤机制的研究

研究背景

材料和方法

结果

1、肝功能变化

2、病理观察结果

3、肝组织NF-KappaB亚基（P50蛋白和P65蛋白）表达

4、血清TNF-α的表达

5、TUNNEL法细胞调亡检查

6、半定量RT-PCR检测结果

8、EMSA结果

图1

图2

讨论

小结

参考文献

第三部分iNOS在大鼠肝移植小移植物模型早期损伤中的表达及意义

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

致谢

综述1肝移植缺血再灌注损伤的研究进展

一、病理生理学

二、外科相关性

三、缺血、再灌注损伤机制

三、肝脏缺血再灌注损伤的防治

五、总结

参考文献

综述2劈离式肝移植的现状和进展

综述3肝脏移植免疫耐受研究进展