延迟整流钾通道在被动致敏的人气道平滑肌细胞中的表达及与气道重塑关系的研究

摘要

支气管哮喘是一种气道的慢性非特异性炎性疾病，其特征为可逆性气道狭窄和气道的高反应性。细胞膜电位(Em)在平滑肌兴奋性及其张力水平的调控中具有重要地位，它通过控制细胞膜钙离子通道的活性而影响细胞内钙离子的浓度。静息状态下，钾离子是形成Em的主要电流成分。气道平滑肌细胞(ASMCs)表现有多种类型的钾通道。研究表明，至少有三种钾通道在决定细胞膜电位，维持气道电活动的相对稳定，及调节气道对收缩舒张因子的反应性和神经系统对递质的释放方面起着重要作用。这三种钾通道分别为：钙激活K+通道；ATP敏感K+通道；电压依赖性延迟整流性钾通道(Kv)。由于这些钾通道的结构及在气管和各级支气管分布的不均一性，使其在气道平滑肌的功能方面起着不同的作用。有研究表明，Kv是决定气道平滑肌Em水平的重要钾通道之一。 第一部分:哮喘血清被动致敏后电压依赖性延迟整流钾通道表达及其功能的变化 分题一:延迟整流钾通道在哮喘患者血清被动致敏的人支气管平滑肌张力调控中的作用 目的:探讨延迟整流钾通道(Kv)在正常与哮喘患者血清被动致敏的人支气管平滑肌(HBSM)张力调控中的作用。 方法:采用等长张力测定法，观察Kv通道阻断剂对正常的与哮喘患者血清被动致敏的HBSM静息和收缩张力的影响。 结果:1.哮喘患者血清被动致敏组的HBSM对组胺产生的收缩反应明显强于正常对照组。2.Kv的阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)可引起静息状态下两组HBSM产生浓度依赖性收缩反应，且致敏组对4-AP的所致收缩的敏感性强于正常对照组，即量效曲线中被动致敏组达到最大效应的一半时所需浓度的负对数值(pD2)明显升高；但两组的最大收缩强度(Emax)无明显差异；KCa的阻断剂四乙基铵(TEA)和KATP的阻断剂格列苯脲(Glib)对HBSM静息张力无明显影响。3.4-AP预处理标本后，可明显增加对照组支气管环对组胺的收缩反应，即处理后Emax明显高于处理前；但不影响致敏组对组胺的收缩反应，即致敏组处理前后Emax无显著性差异。 结论:1.Kv主要参与静息状态下HBSM张力的调控，而KCa、KATP对其无明显影响。2.哮喘患者血清被动致敏后的HBSM的Kv活性下降，此变化可能是哮喘形成和发病的机制之一。 分题二:哮喘患者血清被动致敏对人支气管平滑肌细胞Kv通道活性及其表达的影响 目的:探讨哮喘患者血清被动致敏对人支气管平滑肌细胞(HBSMCs)电压依赖性延迟整流钾通道(Kv)活性及其亚型Kv1.5表达的影响。 方法:1.采用全细胞膜片钳技术，观察哮喘患者血清被动致敏后HBSMCs的Kv通道电流及细胞膜电位的变化。2.采用免疫荧光法、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot技术，检测哮喘患者血清被动致敏对HBSMCs的Kv通道表达的影响。 结果:1.哮喘患者血清被动致敏可使细胞显著去极化。膜电位从-(41.3±6.4)mV(n=14)到-(26.7±5.2)mV(n=12，P＜0.01)；同时，可显著抑制HBSMCs的Kv通道电流，使电流—电压(Ⅰ-Ⅴ)关系曲线明显下移。+50mV时，被动致敏显著抑制Kv电流密度(从54.6±8.7pA/pF到32.1±7.1pA/pF，n=10，P＜0.01)。2.哮喘患者血清被动致敏后，体外培养的HBSMCs的Kv1.5mRNA的表达明显降低(A值从1.04±0.13到0.76±0.07，n=4，P＜0.05)；同时，免疫荧光法、Western-blot检测Kv1.5蛋白质的表达亦明显下降(OD值从2200±380到984±168，n=4，P＜0.05)。 结论:哮喘患者血清被动致敏后的HBSMCs的Kv通道活性及其表达均显著下降，此变化可能是哮喘的发病机制之一。 第二部分:钾通道对人气道平滑肌增殖的影响 分题一:钾通道对人支气管平滑肌细胞增殖与凋亡及其相关基因表达的影响 目的:探讨电压依赖性延迟整流钾通道(Kv)、钙激活钾通道(KCa)和ATP敏感性钾通道(KATP)对人支气管平滑肌细胞(HBSMCs)增殖与凋亡及其相关基因表达的影响。 方法:支气管组织取材于5例肺癌切除术患者癌旁正常的肺组织，将培养的HBSMCs分为4组：(1)对照组(用不含药物的无血清培养基处理)；(2)4-氨基吡啶(4-AP)组(含4mmol/L的4-AP)；(3)四乙基铵(TEA)组(含1mmol/L的TEA)；(4)格列本脲(Glib)组(含0.1mmol/L的Glib)。采用流式细胞术观察细胞的周期，应用荧光光度法检测细胞内钙，四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色分析法检测细胞的增殖，DNA末端转移酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞的凋亡、免疫细胞化学技术检测增殖细胞核抗原(PCNA)及凋亡相关基因Fas和FasL的表达，以观察三种钾通道阻断剂对培养的HBSMCs增殖及凋亡的影响。 结果:1.Kv阻断剂4-氨基吡啶(4-AP)可显著提高HBSMCs吸光度值，促进其增殖细胞核抗原的表达，增加细胞内Ca2+的浓度，使S+G2M期细胞数显著增多(P均＜0.01)；而KCa阻断剂四乙基铵(TEA)和KATP阻断剂格列本脲(Glib)对上述指标的影响，与正常对照组比较，差异均无显著性(P均＞0.05)。2.4-AP可并显著降低HBSMCs凋亡率及其相关基因Fas和FasL的表达(P均＜0.01)。TEA组及Glib组的凋亡率及Fas和FasL的表达，与对照组比较差异均无显著性(P均＞0.05)。 结论:抑制HBSMCsKv的活性，可提高细胞内Ca2+浓度，促进细胞的增殖，抑制其凋亡；而KCa和KATP对HBSMCs的增殖及凋亡均无明显作用。 分题二:反义Kv1.5寡核苷酸转染对人气道平滑肌增殖的影响目的探讨转染反义Kv1.5寡核苷酸(ODNs)对人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖及凋亡的影响。 方法:将培养的HASMCs分为四组：空白对照组(A组)、反义ODNs转染组(B组)、正义ODNs转染组(C组)及随机错配ODNs转染组(D组)。运用基因转染技术进行转染。通过Western免疫印迹法观察转染前后Kv1.5蛋白表达的变化；通过流式细胞术观察细胞周期的变化；采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法、DNA末端转移酶介导的原位缺口末端标记技术(TUNEL)及免疫细胞化学技术检测HASMCs的增殖和凋亡。 结果:1.Western-blot显示转染反义ODNs后，Kv1.5蛋白的表达为(32±5)％，与空白组(100±15)％相比，其表达水平明显降低(P＜0.01)。2.B组S期、G2M期细胞数显著增多，且细胞增殖率为0.687±0.112，与A组(0.313±0.084)比较，差异有显著性(P＜0.01)；同时，B组细胞的凋亡率为(4.68±0.57)％，与A组[(9.68±0.96)％]比较差异亦有显著性(P＜0.01)，且B组细胞凋亡相关基因Caspase-3的表达(0.061±0.007)较A组(0.141±0.012)明显下降(P＜0.01)。而C组、D组与A组比较，上述指标的差异均无显著性(P均＞0.05)。 结论:转染反义Kv1.5寡核苷酸能促进HASMCs的增殖、抑制其凋亡，此为进一步探讨哮喘气道重塑的机制提供了实验资料。 分题三:Kv1.5基因转染在人气道平滑肌细胞增殖作用中的研究 目的:转染Kv1.5基因对人气道平滑肌细胞(HASMCs)增殖及凋亡的影响。 方法:通过脂质体介导瞬时转染Kv1.5基因于培养的HASMCs中，以转染空载体pRc/CMV的细胞及未转染质粒的细胞为对照；应用Western-blot检测平滑肌细胞Kv1.5蛋白表达的变化，验证质粒转染是否成功；采用荧光光度法检测HASMCs胞内钙浓度；通过流式细胞术观察细胞周期的变化；采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量比色法检测HASMCs增殖及DNA末端转移酶介导的原位缺口末端标记技术(TUNEL)检测细胞的凋亡。 结果:1.转染质粒组Kv1.5蛋白质的表达明显增加(P＜0.01)。2.与未转染组及空载体转染组细胞相比，转染质粒组细胞胞内钙浓度明显下降(P＜0.05)，且其细胞中的G0/G1期细胞比例明显升高，细胞增殖率显著下降(P＜0.01)；同时，转染质粒组细胞的凋亡率明显增加，与未转染组及空载体转染组细胞比较差异均有显著性(P＜0.01)，与未转染组及空白质粒转染组细胞相比有显著性差异(P＜0.01)。 结论:转染Kv1.5基因能抑制HASMCs的增殖、促进其凋亡，为进一步探讨哮喘气道重塑的机制及其治疗提供实验依据。 总结:本实验通过从组织水平、细胞水平及分子水平，对人气道平滑肌细胞(HASMCs)进行了系列的研究，得出以下结论：1.在HASMCs存在的K+通道中，Kv主要参与静息状态下HASM张力的调控。2.抑制HASMCsKv通道的活性或表达，可导致细胞内钙离子浓度的升高，细胞的增殖增加，凋亡抑制，而KCa、KATP对上述均无明显作用；增加HASMCsKv通道的表达可得出相反的结果。以上结果提示，HASMCsKv活性或表达的抑制，可能参与了哮喘气道的重塑。3.哮喘患者血清被动致敏可显著抑制HASMCs的Kv通道的活性及表达，提示，哮喘高反应性的发生和发展可能与Kv通道的活性或表达下调有关。 。

目录

缩略语一览表

第一部分延迟整流钾通道在被动致敏人气道平滑肌中的表达及功能的研究

分题一延迟整流钾通道在哮喘患者血清被动致敏的人支气管平滑肌张力调控中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

分题二哮喘患者血清被动致敏对人支气管平滑肌细胞KV通道活性及其表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

附图

第二部分钾通道对人气道平滑肌增殖的影响

分题一钾通道对人支气管平滑肌细胞增殖与凋亡及其相关基因表达的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

分题二反义Kv1.5寡核苷酸转染对人气道平滑肌增殖的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

分题三Kv1.5基因转染在人气道平滑肌细胞增殖作用中的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附图

综述 钾通道开放剂与哮喘和慢性阻塞性肺病

致谢