人类在体增殖细胞的细胞周期调控机制

摘要

第一部分：人类在体增殖细胞的细胞周期调控因子研究 目的：正常生理状态下，人体组织器官内存在大量处于增殖和分裂的细胞，如骨髓幼稚单个核细胞，表皮基底细胞和口腔粘膜细胞等。对于这些体内维持自我更新和持续分裂的细胞，其细胞周期的调控机制还不清楚。因此，在本部分研究中，首先探讨正常生理条件下人体增殖细胞的增殖能力及细胞周期调控因子的表达情况。 方法：以正常人体骨髓单个核细胞(BMMNC)为研究对象，建立在体内增殖细胞研究模型。骨髓单个核细胞经分离，纯化后，采用BrdU掺入合成法和Ki67/DNA双参数流式细胞术分别检测S期细胞比例和细胞增殖能力；Western-Blotting分析各种细胞周期调控分子Cyclins(A,B1,D1,D3,E)，CDKs(CDK1，2，4，6)及CKI(P27，P21,P16,Rb)的表达；并与正常人外周血淋巴细胞(PBL)作为进行对比分析。 结果：正常骨髓单个核细胞S期和Ki67阳性细胞比例分别为21.72％，31.43％，低于体外刺激培养的淋巴细胞(分别为30.14％，45.14％)。Western-Blotting结果示MNCCyclinA,B1及CDK1,2明显表达，含量略低于体外培养的淋巴细胞；CyclinD3，E及CDK6无表达或仅微弱表达；CyclinD1及CDK4无表达；P27蛋白高表达，P16，P21无表达；Rb磷酸化水平低于体外培养淋巴细胞，¨30蛋白无表达，P107明显表达。 结论：骨髓单个核细胞(BMMNC)具有明显的细胞分裂周期，增殖能力低于体外刺激培养的正常淋巴细胞(PBL)，细胞周期调控因子在体内MNC和体外PBL中的表达并不完全相同，有部分细胞周期调控因子无表达或仅低水平表达，这些结果提示人类在体内增殖细胞的细胞周期调控机制可能与传统的体外培养细胞存在差别。 第二部分：人类在体增殖细胞的细胞周期核心调控机制——Cyclins时相性起伏及CDKs序列激活的规律 目的：本研究的最终目标锁定在人类细胞周期真实机制的阐明之上。在建立人类在体增殖细胞的研究模型，研究了细胞周期调控分子的表达的基础之上，重点探讨人类在体内的细胞周期核心调控机制——Cyclin时相性起伏及CDKs序列激活的规律。 方法：Cyclins时相性表达规律：正常骨髓单个核细胞(BMMNC)经分离，纯化后，采用：(1)Cyclins/DNA多参数流式细胞术检测四种Cyclins(D，E，A，B1)在细胞周期不同时相中的表达；(2)分选后蛋白电泳技术检测四种Cyclins(D，E，A，B1)在细胞周期不同时相中的表达；(3)分选后共聚焦显微镜技术分析Cyclins在细胞周期不同时相中的空间定位分布。CDKs序列激活的规律：(1)分选后免疫共沉淀技术分析Cyclins和CDKs的相互结合规律；(2)分选后激酶活性分析技术检测CDKs的活性表达规律。对照采用正常人外周血刺激培养的淋巴细胞。 结果：正常骨髓单个核细胞(BMMNC)中四种Cyclins的表达规律不同于体外刺激培养的正常淋巴细胞，表现为：CyclinD1无表达，CyclinD3和CyclinE无表达或仅在G1期有微弱表达，CyclinA和CyclinB1在G1期即开始表达，S和G2/M期含量逐渐上升。共聚焦显微镜发现，MNC中CyclinA和CyclinB1在G1期位于细胞浆内，在S期，胞浆和胞核均有合成，而在G2/M期，主要分布于胞核。免疫共沉淀结果表明，在G1期，MNC中CyclinB1和CyclinA均与CDK1结合，在S期CyclinA/CDK1结合最多，在G2/M期CyclinB1/CDK1结合最多；而参与体外细胞G1期调控的CyclinD未检测到与CDK4或CDK6结合，仅有少量的CyclinE/CDK2在G1期，CyclinA/CDK2在S期结合。激酶活性分析发现MNC中CDK1激酶在G1期开始激活，S期，G2/M期活性逐渐增强；CDK2激酶仅在G1期有很弱的活性，S期消失；CDK4和CDK6无激酶活性。 结论：人类在体增殖细胞的细胞周期核心调控机制——Cyclin时相性起伏及CDKs序列激活规律与传统的体外培养细胞存在明显差别。 第三部分：人类肿瘤细胞Cyclins表达规律 目的：细胞周期调控因子功能异常导致细胞周期紊乱是肿瘤发病的重要原因。当阐明了人类正常增殖细胞Cyclins的时相性起伏规律之后，接下来我们对人类肿瘤细胞Cyclins的存在及时相性起伏规律的异常进行研究，从而为肿瘤的发病机制，诊断和治疗解决最基本和关键的科学问题。 方法：临床白血病肿瘤细胞经分离，纯化后，采用Cyclins/DNA多参数流式细胞术检测四种Cyclins(D，E，A，B1)在细胞周期中的时相性表达，与正常人体增殖细胞的Cyclins进行对比，Cellquest软件定量分析肿瘤Cyclins的异常规律。 结果：临床白血病肿瘤细胞四种Cyclins的表达规律不同于体内的正常增殖细胞：CyclinD3和CyclinA表达异常升高；CyclinE也有轻度的增高，但不如前两者明显；CyclinB1含量下降，以G1期细胞最为明显。 结论：人类肿瘤细胞Cyclins(D3，E，A，B1)的表达发生异常改变，该异常可能是导致细胞周期运行失控的机制之一。 第四部分：人类培养细胞的最佳体内“模拟态” 目的：细胞培养技术建立以来，人们多以人类细胞的体外培养作为其体内的“模拟态”(mimicmode)，通常以培养细胞的同步化或非同步化培养细胞的对数生长期作为研究模型。前面的研究，证实了在这些体外“模拟态”下，细胞周期调控机制与体内的真实机制存在明显差异，因此，寻找并筛选出体外培养细胞最佳“模拟态”，对于人类细胞周期的分子调控机制及肿瘤治疗的研究具有重要的实验指导意义。 方法：建立两种体外生长“模拟态”：(1)对数生长期的白血病细胞(MOLT-4)和肝癌细胞(HepG-2，Bel-7402)；(2)拥挤生长的白血病细胞(MOLT-4)和肝癌细胞(HepG-2，Bel-7402)。体内生长模型：(1)骨髓单个核细胞；(2)接种于裸鼠皮下生长的肝癌细胞(HepG-2，Bel-7402)。采用：(1)Cyclins/DNA多参数流式细胞术检测四种Cyclins(D，E，A，B1)在细胞周期不同时相中的表达；(2)分选后蛋白电泳技术检测四种Cyclins(D，E，A，B1)在细胞周期不同时相中的表达；(3)分选后共聚焦显微镜技术分析Cyclins在细胞周期不同时相中的空间定位分布。 结果：与对数生长期相比，拥挤生长的培养细胞Cyclins时相性规律发生了改变：CyclinD3和CyclinE含量下降；CyclinA和CyclinB1异时相表达于G1期，伴随S和G2/M期含量下降；异时相表达的CyclinA和CyclinB1主要位于细胞浆，该模式与人体内正常骨髓单个核细胞和裸鼠体内接种细胞类似。 结论：体外拥挤生长细胞的Cyclins表达与体内真实规律一致，是体内增殖细胞周期研究的最佳“模拟态”。

目录

引 言

第一部分：人类在体增殖细胞的细胞周期调控因子研究

摘要

前 言

材料及方法

讨 论

参考文献

第二部分：人类在体增殖细胞的细胞周期核心调控机制——Cyclins时相性起伏及CDKs序列激活的规律

摘要

前 言

材料及方法

讨论

参考文献

第三部分：人类肿瘤细胞Cyclins表在规律

摘要

前 言

材料及方法

讨 论

参考文献

第四部分：人类培养细胞的最佳体内“模拟态”

摘要

前 言

材料及方法

讨 论

参考文献

全文总结

文献综述细胞周期调控机制的研究历程——从酵母，蟾蜍，果蝇，到哺乳动物和人类

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