重组腺相关病毒载体介导的人类组织型激肽释放酶基因对高血压的治疗作用

摘要

重组腺相关病毒载体是一种近年来被广泛研究的基因载体。本文从几个不同的方面对重组腺相关病毒载体介导的人类组织型激肽释放酶基因对高血压的治疗作用进行了研究和探讨。 PART1引进了自发性高血压大鼠(sHR)模型，随机分成三组，每组6只。分别经尾静脉注射rAAV-HK(实验组)和rAAV-lacZ(对照组)，每只注射1×1011p.f.u.。注射后每周监测动脉收缩压，每2周收集24小时尿。同时观察动物行为变化，实验周期为19周。19周后经麻醉处死动物，并取心、肝、肾、脑等组织作以下研究。用RT-PCR和ELISA检测RNA和蛋白质的表达和分布情况；检测尿中微量白蛋白的含量及变化；主要脏器称重并固定切片作形态学分析以观察肾脏损伤情况和心血管重构情况。 结果：重组腺相关病毒载体介导的人类组织型激肽释放酶基因可以在动物体内持续稳定的表达，在降低动物血压的同时，还可以预防长期高血压带来的各种并发症包括肾脏损害，心血管系统重构等，而且实验过程中两组动物并未出现病毒载体注入和表达引起的毒副作用。文章已经发表在GENETHERAPY(SCIIF5.6)，2004(11). PART2.在高血压的治疗的问题上，给药途径也是一个需要解决的问题。现在在临床上，大部分药物都是口服制剂，而基因治疗所用的制剂基本上是通过静脉给药。而由于激肽释放酶是一种分泌型酶蛋白，可以从细胞中释放到血液中从而发挥它的生理效应，所以没有必要自静脉给药。而骨骼肌是一种由非分裂细胞组成的器官，由于它作为一种给药途径有很多优势，例如：肌肉组织占一个成人全身体重的40％，分布区域广泛，血液循环丰富；骨骼肌适合于很多用于基因治疗的载体系统；它可以合成许多非肌肉蛋白质成分并释放到循环系统中；肌肉组织基本上没有细胞更替。所以这些因素使之成为理想的基因表达载体媒介。所以很多基因治疗研究组把它作为一种主要的给药途径进行研究。 结果：重组腺相关病毒携带人类激肽释放酶基因经肌肉注射自发性高血压大鼠，仍然可持续稳定的表达，不但可以持续稳定降低血压，还可以预防长期高血压带来的各种并发症如肾脏损害，心血管系统重构等，而且实验过程中两组动物并未出现病毒载体注入和表达引起的毒副作用。进一步证实了rAAV-HK对高血压动物有良好的治疗效应，而且证明骨骼肌可以作为高血压基因治疗的重要给药靶器官。 PART3.通过用rAAV介导HK在人体内长期表达和治疗高血压时，人们的另外一个顾虑就是，生物体的血压是波动的，当血压正常或较低时，HK过度表达是否会进一步降低血压。因此在这部分研究工作中，我们取正常SD大鼠(spragueDawleyrats，SDrats)，静脉给予rAAV-HK和rAAV-lacZ病毒，在HK高表达的同时，观察其对正常大鼠血压的影响。结果发现，静脉给予1×1011p.f.u.的rAAV-HK，观察5周对动物血压没有明显影响，尿量，尿Na+,K+离子浓度也没有明显的变化。这表明即使有过量HK表达，由于体内的自身调节作用，对动物血压不会产生明显影响，提示在基因治疗时可能不会导致人体的低血压。 在第二阶段实验中，自基因注射第5周开始给予高盐饮食，对照组动物的血压开始逐渐上升，从最初的122.3±1.13mmHg，到第13周达到了142.4±1.77mmHg，而试验组动物的血压则稳定在基线水平，约121.9±1.73mmHg，到试验结束时为，两组动物的血压有显著性的差别(n=6,P＜0.05,ANVOA)。RT-PCR检测发现rAAV介导的HK基因在各个主要脏器都有表达，而ELISA检测发现实验组动物尿中自第三周开始检测到HK蛋白质，含量在3.67±0.135μg/ml左右，此后11周的HK排泄量一直维持4.32±0.268μg/ml左右。生化指标和其他的一些指标分析发现，rAAV-HK组的体重，尿量，尿渗透压，尿Na+，K+离子浓度明显高于对照组。这些试验结果说明了rAAV-HK注射后，对正常水平的血压和肾脏功能没有明显的调节作用，而对高盐诱导的高血压有长期有效的治疗效果，并对高盐负荷引起的肾脏损害能够产生良好的保护作用，从而进一步证实了重组腺相关病毒携带的激肽释放酶基因具有良好的治疗效应。 PART4.血压对机体的损害作用不只是在于血压增高本身，还因为心血管系统的细胞增殖和细胞凋亡的失衡，从而导致终末器官重构，并引起功能损害。对新生高血压动物的试验说明：起初在心脏，肾脏和血管中的细胞凋亡(apoptosis)过程是被抑制的，同时组织细胞是肥厚增生的，从而在器官上的表现就是代偿性的肥厚，而随着病情的进展和年龄的增长，这种代偿机制就会失衡，细胞凋亡和细胞增殖的平衡过程逆转，于是发生终末器官重构，组织纤维化，继而出现功能的损害。而激肽释放酶-激肽系统作为一种非常重要的心血管系统保护因子在最近被广泛的研究。人们发现激肽释放酶-激肽系统有心脏保护作用，可预防和逆转心血管系统重构，同时还有肾脏保护作用，这在多种动物模型中得到了证实。 这项研究中，取以上试验中的动物组织和切片，研究激肽释放酶基因对SHR心血管和肾脏保护作用的分子机制，包括对这些组织细胞凋亡的影响，及细胞增殖和细胞凋亡的信号传递系统的改变情况。结果如下：TUNEL(Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediatednickendlabelingassay)染色的结果说明rAAV-HK组主要脏器的凋亡细胞比例明显小于对照组，用westernblot方法检测两组动物中MAPK(TheMitogen-ActivatedProteinKinase)、PI3K(Phosphatidylinositol3-Kinase)/Akt总蛋白表达和磷酸化水平的结果显示：rAAV-HK组MAPK和Akt磷酸化水平及PI3K蛋白表达明显高于对照组，两组比较有显著差异(P＜0.01)。总的MAPK和Akt的表达则没有明显变化，因此认为rAAV-HK病毒注射后，激肽释放酶的高表达可以激活MAPK和PI3K/Akt通路来促进SHR终末器官的增殖效应。而rAAV-HK组Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达较对照组增高(P＜0.01)，Bax表达明显降低(P＜0.01)。 小结：研究证明：(1)rAAV介导的人类组织型激肽释放酶基因(rAAV-HK)经静脉导人体内后，在长期有效表达的同时，有效降低了动物血压并显著减轻了高血压所致的器官损害；(2)进一步经肌肉注射途径给药也达到了同样的效果；(3)我们还证明，rAAV-HK体内转染和表达对正常SD大鼠血压没有明显影响，相反却能预防高盐饮食诱导的高血压的形成；(4)rAAV-HK的保护机制研究显示，SHR大鼠肾脏等器官凋亡细胞较正常大鼠明显增多，而rAAV-HK治疗组凋亡细胞显著减少。分子机制研究证明，rAAV-HK治疗组动物肾脏等器官MAPK及Akt/PI3K信号系统明显激活，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL明显上调，而Bax显著减低。进一步采用人肾上皮细胞进行的研究也证明激肽-缓激肽系统能明显减轻TNF-a诱导的细胞损伤和凋亡，而且其机制与MAPK及Akt/PI3K信号系统有关。本项目首次采用rAAV介导HK基因进行高血压基因治疗研究并证明安全有效。本项研究结果为下一步开发rAAV-HK基因药物的临床应用奠定了基础。

目录

前言

rAAV-HK病毒的包装

第一部分：静脉注射rAAV-HK对SHR的治疗作用

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分：肌肉注射rAAV-HK对SHR的治疗作用

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分：重组腺相关病毒载体介导激肽释放酶基因对正常血压的影响和对高盐饮食诱导高血压大鼠的预防作用

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

材料和方法

实验结果

FARTⅠ动物实验部分

FAPTⅡ细胞水平研究激肽释放酶-激肽系统的抗凋亡机制的结界

讨论

小结

参考文献

附 录

缩略语

主要液体配制

综述 激肽释放酶-激肽系统与心血管系统疾病

致谢

Pecombinant adeno-ass ociated virus-mediated kalikrein gene therapy reduces hypertension and attenuates its cardiovascular injuries