端粒酶hTERT基因反义RNA表达载体的构建及其对肝癌细胞SMMC-7721的作用

摘要

本文以分子克隆技术成功构建人端粒逆转录酶(hTERT)基因反义RNA表达载体，研究其对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响。采用聚合酶链反应（PCR）扩增hTERT基因片段，经测序证实后，反向插入到表达载体pcDNA3.1/myc-His中，成功构建hTERT基因反义表达载体pcDNA3.1-hTERT(as)，经脂质体介导转染人肝癌细胞株SMMC-7721,通过新霉素类似物(G418)筛选获得表达端粒酶hTERT基因反义RNA的稳定细胞株。采用噻唑蓝（MTT）法、端粒重复序列扩增-酶连免疫吸附检测法（TRAP-ELISA）、流式细胞术和荧光定量PCR仪分别观察细胞的增殖、端粒酶的活性和细胞凋亡及细胞hTERT基因mRNA的水平，结果发现：通过细胞生长曲线的绘制和MTT法研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响；通过TRAP-ELISA法研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞端粒酶活性的影响；通过流式细胞仪研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞的凋亡和细胞周期的影响；通过荧光定量PCR仪研究端粒酶hTERT基因反义RNA对肝癌细胞的hTERTmRNA水平的影响。本研究表明，hTERT基因反义RNA可有效抑制肝癌细胞生长和诱导细胞凋亡，为反义RNA治疗肝癌提供了实验基础，为肝癌的基因治疗提供了一种新的方法。