聚酰胺-胺型树状大分子介导基因传递的研究

摘要

基因治疗成功的关键是需要高效/安全和靶向的载体系统，将DNA转移至靶细胞核内进行表达。聚酰胺-胺型树状大分子（PAMAM）是一类纳米级的聚合物分子，具有高度支化的球形结构，分子内含有大量的伯胺和叔胺基团，能与DNA自组装形成带正电荷的紧凑复合物，将DNA输送至多种类型的细胞中。在本论文中，我们对DNA和PAMAM的相互作用及其动力学过程进行了系统的表征，并研究聚丙交酯乙交酯（PLGA）/聚乳酸（PLA）和阳离子脂质体与PAMAM和DNA复合物的组装行为及其对转染效率的影响。完成的工作包括以下几个方面： （1）通过琼脂糖凝胶电泳/[Ru(phen)2dppz]2+置换和排除实验/粒径和电位测试考察PAMAM与DNA的相互作用，圆二色谱（CD）和傅立叶红外光谱（FTIR）研究二者组装过程中DNA构象的变化。结果表明，PAMAM与DNA在N、P比大于1.5时形成了稳定且带正电荷的复合物，平均粒径在150-180 nm范围内。与裸质粒相比，DNA与PAMAM复合后270 nm处CD信号强度减弱，峰位置发生红移；增加溶液离子强度/过低或过高的Ph值都会引起CD信号的降低，说明DNA螺旋结构发生了变化。FTIR光谱研究表明复合状态的质粒DNA仍保留其典型的B型构象，只是其碱基堆积作用受到了强烈的扰动。 （2）应用荧光停流技术研究DNA与PAMAM相互作用的动力学，包括两者的复合过程及其逆过程（即DNA从复合物中的解离）。结果表明DNA的压缩是复合过程的速率决定步骤，而DNA的伸展和去折叠是解离过程的速率决定步骤。在较低的N、P比时，形成的PAMAM、DNA复合物是松散的，可在一定程度内发生解离。而在N、P比达到2.0以上后，DNA在PAMAM的作用下被完全压缩，复合物处于热力学最稳定的状态，解离变得越来越困难。 （3）采用乳化-分散-蒸发方法制备了含PAMAM的PLGA纳米粒，并与DNA复合。通过琼脂糖凝胶电泳/荧光置换/粒径和电位测试表征复合物的形成，核酸酶酶切实验考察复合物对DNA的保护作用，噻唑蓝（MTT）方法研究复合物的细胞毒性，同时应用体外转染实验研究复合物的转染效率。结果表明DNA与阳离子纳米粒在N、P比2以上形成了稳定/紧凑的复合物。复合物的zeta电位在低N、P比时为负值，随N、P比的增加而增加，并在N、P比2以上时变为正值。酶切实验表明复合物能保护DNA抵御酶的降解作用。复合物的细胞毒性较小，对HepG2和NIH-3T3细胞的生长状态没有太大的影响。在无血清介质中，DNA与阳离子纳米粒形成的复合物可以被有效地转移到这两种细胞内得到表达，其转染效率比PAMAM、DNA复合物明显升高。而且，转染的最佳N、P比为0.9-1.5，复合物还没有达到完全压缩的状态，可能有利于DNA从复合物中解离出来并进入细胞核。 （4）采用乳化-分散-蒸发方法制备了含PAMAM的PLA纳米粒，并与DNA复合，考察复合物的理化性质/细胞毒性和转染效率。琼脂糖凝胶电泳/荧光置换/粒径和电位测试的结果表明在N、P比2以上时，DNA与阳离子纳米粒形成了稳定且带正电的复合物。核酸酶酶切实验的结果表明复合物能保护DNA抵御核酸酶的降解。MTT实验的结果说明复合物的细胞毒性较小。在无血清介质中，阳离子纳米粒可以将DNA有效地转移到两种细胞内得到表达，转染效率与单纯的PAMAM相比有明显的提高，且转染的最佳N、P比为2-5。 （5）薄膜超声法制备DOTAP、DOPE阳离子脂质体，并与PAMAM和DNA形成三元复合物，考察其理化性质/细胞毒性和转染效率。结果表明在PAMAM与DNA比例r=0.5以上时（实验中阳离子脂质体、DNA的比例r’固定为3.0），形成了稳定的复合物，能保护DNA免受核酸酶的降解，但是对细胞生长有一定程度的抑制。在有血清介质中，与单纯的阳离子脂质体或PAMAM相比，该三元复合物在一定的r值范围内（从1.2到2）对HepG2细胞具有较高的转染效率。 综上所述，PAMAM与DNA通过静电相互作用自组装形成复合物，在一定程度内可发生解离；但是当N、P比大于2.0时，两者的结合呈现出不可逆的趋势。此外，PLGA/PLA纳米粒和阳离子脂质体对PAMAM介导的转染效率有一定的促进作用。