单细胞水平实时荧光定量聚和酶链反应在诊断唐氏综合征中的应用探讨

摘要

目的: 探讨应用实时荧光定量聚合酶链反应技术在单细胞水平进行唐氏综合征基因诊断的可行性与实用性，为稳定、准确、简便和快速的诊断唐氏综合征提供实验依据，并进一步为唐氏综合征的无创性产前诊断提供实验基础。
　　 方法: 采集21名唐氏综合征患者外周血及1名唐氏综合征胎儿脐血样本、40名正常对照者外周血样本。所有血样均经密度梯度离心提取有核细胞层，制作细胞涂片并经瑞氏染色，显微操作分离单个淋巴细胞。采用15碱基随机引物延伸预扩增，和实时荧光定量PCR技术特异扩增细胞基因组12号染色体上GAPDH基因、21号染色体上S100B基因和DSCR1基因位点，分别作为内参照管家基因和目标序列，用于对病例组和对照组各基因的含量进行相对定量比较。成组t检验比较病例与对照两组间目的基因与管家基因CT荧光阈值的差值（ΔCT）有无差异，根据比较阈值法计算S100B病例组/S100B对照组、DSCR1 病例组/DSCR1对照组的值。
　　 结果: 每位实验对象均随机挑取3个有核细胞，将各单细胞PEP产物分别进行GAPDH、S100B和DSCR1三个基因位点扩增。两组对象共62名，均成功扩增出至少2个细胞的三个基因。3个基因位点全部扩增成功率为79.0%（147/186），21%（39/186）单细胞PEP产物未能扩增出全部基因。病例与对照组间ΔCT值差异有统计学意义（P<0.01），病例组平均值低于对照组。由比较阈值法计算得到唐氏病例组21号染色体上特异序列相对于正常对照组的含量比值，即S100B病例组/S100B对照组、DSCR1病例组/DSCR1对照组的值分别为1.891（1.563～2.287）、1.840（1.562～2.168）。
　　 结论: PEP是一种建立在特殊反应条件下的微量全基因组扩增技术，其对模板的放大能够充分满足多基因位点同时检测的需要，随机引物的使用使其扩增具有良好的平衡性。实时荧光定量PCR是一种高灵敏度的基因定量检测方法，其扩增体系结果稳定，可以有效区分唐氏综合征病例与健康对照人群，并为以单细胞检验为基础的无创性产前诊断及植入前遗传学诊断提供了新的诊断思路。以PCR为主要技术路线，可以快速、简便的在24小时内完成唐氏综合征的基因诊断，结果较准确，在临床上有广阔的应用前景。