pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA-交联明胶微球复合物的制备及其性质检测和分析

摘要

实验一、交联明胶微球的制备及其物理性质的检测和分析。 目的：制备交联明胶微球并检测和分析其物理性质。 方法：以普通碱性明胶为原料，25％戊二醛水溶液为交联剂，采用改良的双相乳化冷凝交联法制备交联明胶微球。采用扫描电镜观察微球微观形态，测定微球在37℃生理盐水中充分溶胀前后的平均直径和最大溶胀率。微电泳法测定微球的表面电荷。采用紫外分光光度法检测交联明胶微球结合和体外缓释pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA的性能和剂量－时间规律。 结果：交联明胶微球呈分散良好的均匀球体，表面可见孔道散在分布。干燥状态下微球的平均直径为21.13±1.42μm，在37℃生理盐水中充分溶胀后的平均直径为26.72±1.74μm，两者相比具有明显统计学差异(P<0.05)。微电泳法测定微球表面携带正电荷。交联明胶微球在37℃生理盐水中的最大溶胀率为27.32±0.45％。当pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA与交联明胶微球的质量比为1:10时，微球结合质粒DNA达到饱和状态，此时的包封率为62.75±3.31％。所形成的pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－交联明胶微球复合物在体外能够持续缓释质粒DNA超过4周。 结论：本实验所制备的交联明胶微球能够有效结合pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA形成pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－交联明胶微球复合物，在体外能够持续缓释pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA超过4周。 实验二、交联明胶微球的细胞毒性和生物相容性研究。 目的：检测交联明胶微球的细胞毒性和生物相容性，评价其用于体内应用的安全性。 方法：采用MTT 染色法检测交联明胶微球的细胞毒性程度。通过溶血实验、凝血酶原时间实验和复钙时间实验评价交联明胶微球对红细胞的破坏作用和对凝血功能的影响。通过扫描电镜观察、测定黏附细胞数和细胞迁移实验研究交联明胶微球对体外培养的人脐静脉内皮细胞的黏附和迁移能力的影响。 结果：交联明胶微球的细胞毒性程度维持在1级，并且不随微球降解时间延长和浓度增加而增强。交联明胶微球的溶血率为2.27±0.34％，提示微球没有溶血性。测定微球的凝血酶原时间为16.0±0.7s，与阴性对照组(17.2±0.8s)相比没有统计学差异(P>0.05)；复钙时间为165.4±4.5s，与普通明胶组(169.2±5.4s)和阴性对照组(181.2±3.4s)相比均没有统计学差异(P>0.05)，从而提示微球不会促进外源性和内源性凝血途径的功能。通过扫描电镜观察和在1周末和4周末时测定携带交联明胶微球溶液的Dacron补片表面的黏附细胞数量为(1.47±0.30)×106和(65.34±11.25)×106，分别与普通Dacron补片组的黏附细胞数(1.63±0.26)×106和(62.43±10.06)×106相比均没有统计学差异(P>0.05)，提示微球不会抑制人脐静脉内皮细胞在Dacron纤维表面的黏附。细胞迁移试验测定交联明胶微球组的细胞迁移距离为29.61±3.54μm，与阴性对照组(32.41±4.31μm)和普通明胶组(30.55±5.08μm)相比均没有统计学差异(P>0.05)，提示微球不会抑制细胞的迁移能力。 结论：交联明胶微球没有细胞毒性；不会引起溶血和促进外源性和内源性凝血功能，也不会抑制人脐静脉内皮细胞的黏附和迁移能力，具有良好生物相容性。 实验三、pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－交联明胶微球复合物的体外基因转染实验研究。 目的：检测pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA 质粒DNA－交联明胶微球复合物体外缓释pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA 质粒DNA转染人脐静脉内皮细胞的瞬时转染效率和转染后的tPA蛋白的表达和分泌情况。 方法：以体外培养的人脐静脉内皮细胞HUVECs为转染对象，通过免疫荧光染色技术检测其瞬时转染效率。通过RT-PCR技术检测转染后HUVECs中tPA mRNA转录，通过Western印迹检测技术检测转染后HUVECs中tPA蛋白表达情况。通过ELISA 技术检测HUVECs转染后细胞培养上清液中tPA蛋白含量。 结果：pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－交联明胶微球复合物所缓释的pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA能够成功转移进入HUVECs，其瞬时转染效率为12.74±2.53％，明显高于单纯pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA溶液组(4.63±1.75％)(P<0.05)，但低于pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－阳离子脂质体复合物组(26.49±5.23％)(P<0.05)。RT-PCR提示其转染后转录产生的tPA mRNA 电泳条带的积分光密度值与相应内参β-actin的比值为1.65±0.27，明显高于单纯pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA 质粒DNA溶液组(1.22±0.23)(P<0.05)，但低于pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－阳离子脂质体复合物组(2.07±0.25)(P<0.05)，以上3组均显著高于空白pcDNA3.1质粒DNA载体组(0.86±0.21)和正常培养的HUVECs(0.91±0.18)(P<0.05)。Western免疫印迹技术提示其转染后细胞内有tPA蛋白表达，而空白pcDNA3.1质粒DNA载体组和正常培养的HUVECs中则仅有痕量表达。ELISA实验证明HUVECs转染后所表达的tPA蛋白能够被分泌到细胞培养上清液中，其tPA蛋白浓度为497.2±61.9 ng/ml，高于单纯pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA溶液组(295.7±49.1 ng/ml)(P<0.05)，但低于pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－阳离子脂质体复合物组(862.1±96.8 ng/ml)(P<0.05)。 结论：由pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA－交联明胶微球复合物在体外缓释的pcDNA3.1-Myc-His B(-)/tPA质粒DNA能够成功转移进入HUVECs中并进行转录和表达，转染后细胞所产生的tPA蛋白能够被分泌到细胞外。