过氯酸铵对家兔肺组织致纤维化作用的研究

摘要

目的：本文采用实验动物模型,对家兔进行气管内反复注入过氯酸铵(AP)染毒,观察其体重、脏器系数的变化;采用RT-PCR方法,研究分析过氯酸铵对家兔肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达的影响,探讨该指标在过氯酸铵致肺纤维化中的佐证意义;并研究其肺组织的病理变化,以便为阐明AP的致肺纤维化作用提供科学依据。
　　方法：选用白色健康家兔25只,随机分为5组,分别为AP低(22.5mg/kg)、中(45mg/kg)、高(90mg/kg)剂量组、阴性对照组(生理盐水)和博来霉素阳性组(BLM A5,4mg/只),每组5只。每周一次气管内注入AP染毒并称其体重,共染毒13周。染毒体积:AP0.5ml/kg,博来霉素1ml/只(4mg/只),阴性对照组取等体积的生理盐水。染毒后于第23周进行耳缘静脉采血并处死家兔,取心、肝、脾、肺、肾称量,计算其脏器系数变化。取肺组织用Trizol试剂盒提取肺组织总RNA。取2μl RNA进行逆转录,反应体系为25μl。再取逆转录产物进行PCR扩增,反应体系为25μl。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶(含0.05μl/ml Goldview)中电泳30min,凝胶成像系统下扫描分析,GAPDH作为内对照,TGF-β1和TNF-αmRNA相对含量用其吸光度×面积的值与GAPDH相应值的比值来表示。同时,取肺组织做常规病理(HE)和胶原纤维与弹力纤维(VG)病理切片,观察其变化。
　　结果：家兔经AP反复染毒至第8周和第11、12周,高剂量组和BLM A5组家兔体重均比对照组明显下降(P<0.05)。BLM A5组肺脏器系数(5.05‰)比对照组、低、中剂量组(3.32、3.94、3.58‰)升高显著(P<0.05或P<0.01)。染毒后至第23周,其体重及脏器系数的变化差异无统计学意义。肺组织TGF-β1和TNF-αmRNA表达:AP不同剂量染毒后,低、中、高各剂量组及博来霉素组的TGF-β1(1.11±0.22,1.54±0.18,1.84±0.10,2.36±0.85)和 TNF-αmRNA(1.10±0.24,1.26±0.11,1.87±0.11,2.34±0.75)表达均比对照组(0.47±0.09,0.51±0.24)明显升高,其差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。肺组织病理显示:低剂量组肺间质较对照组明显增厚,细胞显密集;中剂量组显示有大量炎性细胞浸润,并可见少量成纤维细胞;而高剂量组则变化明显,除炎性细胞浸润外,可见肺间质结缔组织有弥漫性增生,并可见明显的成纤维细胞及胶原纤维大量增生。
　　结论：过氯酸铵可引起肺组织损伤,具有一定的细胞毒作用。过氯酸铵可使家兔肺组织TGF-β1、TNF-αmRNA表达增加,表明该细胞因子的增高性变化为提示过氯酸铵的致肺纤维化作用具有佐证性意义。肺组织病理结果表明,较高剂量的过氯酸铵经气管反复染毒,可导致肺纤维化。本研究为首次阐明过氯酸铵的致肺纤维化作用提供了可靠的实验依据。

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前言

材料和方法

一、主要材料和试剂

二、主要仪器PCR扩增仪

三、 动物试验分组与染毒

四、AP剂量的计算与配制

五、总RNA的提取

六、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

七、统计学处理

结果

一、家兔一般情况及体重增长变化

二、家兔各脏器系数的变化

三、家兔肺组织的病理变化

四、 AP染毒家兔肺组织TGF-β1和TNF-αmRNA表达的变化

讨论

参考文献

细胞因子在肺纤维化中的作用

附录一 硕士在校期间发表论文

致谢