纳米二氧化钛和氯化镉联合作用对人肝L-02细胞的毒性作用及其机理研究

摘要

直径小于100nm的颗粒物质称为纳米颗粒或超微颗粒,当颗粒的直径进入纳米级时,其理化性质和生物学效应会发生根本性的变化。随着纳米科技的发展和纳米材料的广泛应用,二氧化钛作为一种常见的纳米材料,与人类接触的机会也迅速增多,其生物安全性问题也越来越受到人们的关注。纳米材料由于具有大量的界面,同时具有很强的吸附能力,从而能对金属离子或有机物产生吸附作用。当纳米材料大量进入环境后,特殊的表面效应使得其极易与环境中的多种污染物结合。重金属镉是一种广泛存在的环境污染物。镉可引起DNA损伤,具有致癌、致畸、致突变作用,是已确定的人类致癌物。作为环境中的常见致癌物,重金属镉与纳米材料的相互作用,对机体可能导致的各种健康效应有何变化,至今尚无研究。系统了解纳米材料与环境常见污染物的联合作用所致健康效应,不仅可以深入了解纳米材料在环境中的变化规律,也为深入了解纳米材料的健康效应提供科学依据。
　　本研究以体外培养的正常人类来源胚胎肝细胞(L-02细胞)为靶细胞,探究纳米二氧化钛(nano-TiO2)与氯化镉(CdCl2)联合作用对L-02细胞氧化应激、DNA损伤和修复、染色体损伤和细胞凋亡的影响,系统研究纳米二氧化钛与氯化镉联合染毒所致 L-02细胞的毒性作用。本文在以往纳米二氧化钛与氯化镉的毒作用机理研究的基础上,用体外试验探讨了二者之间的相互作用及可能的毒性作用机制,为进一步深入了解环境中纳米金属氧化物的健康效应提供实验依据。
　　本文主要从以下两个部分展开论述：
　　第一部分 氯化镉联合纳米二氧化钛诱导人胚肝细胞氧化应激水平和凋亡的作用
　　目的:观察CdCl2、nano-TiO2单独及联合作用对人胚肝细胞(L-02)活性氧(ROS)、氧化应激能力和细胞凋亡的影响。
　　方法:生长良好的人胚肝细胞,分别加入0、0.001、0.01、0.1μmol/L的CdCl2,0、0.01、0.1、1 mg/L的nano-TiO2,以及上述各浓度的CdCl2和nano-TiO2联合作用,将L-02细胞染毒24小时后,检测L-02细胞内活性氧(ROS)的生成、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量、抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性以及L-02细胞凋亡的情况。
　　结果:0.01、0.1μmol/L的CdCl2作用L-02细胞后ROS的生成量显著增加(P<0.05),nano-TiO2单独染毒组 ROS生成量与阴性组比较无显著性变,析因分析结果显示两种受试物混和染毒存在协同作用,(P<0.001);0.1μmol/L的CdCl2可以显著降低SOD和CAT的活性(P<0.05);nano-TiO2单独染毒组SOD和CAT活性与阴性组比较无显著性变,但二者联合作用可降低SOD和CAT的活性(P<0.001);0.01、0.1μmol/L的CdCl2可诱导MDA含量显著增加(P<0.05),nano-TiO2单独染毒组MDA的含量与阴性组比较无显著性变,析因分析结果显示两种受试物混和染毒存在协同作用,(P<0.001);0.01、0.1μmol/L的CdCl2作用L-02细胞凋亡率显著增加(P<0.05),nano-TiO2单独染毒组细胞凋亡率与阴性组比较无显著性变,析因分析结果显示两种受试物混和染毒存在协同作用,(P<0.001)。在本试验浓度范围内,L-02细胞的凋亡率与ROS生成量呈正相关(r=0.976,P<0.001);与MDA的含量亦呈正相关(r=0.950,P<0.001)。
　　结论:CdCl2和nano-TiO2联合作用可诱导L-02细胞氧化应激,使其脂质过氧化反应增强、抗氧化作用降低、细胞凋亡率增加;二者引发的脂质过氧化反应和活性氧自由基可能是促进细胞凋亡的影响因素。
　　第二部分 氯化镉与纳米二氧化钛联合作用对人胚肝细胞DNA损伤和修复的影响
　　目的:观察CdCl2、nano-TiO2单独及联合作用对人胚肝细胞株(L-02)内DNA、染色体损伤以及DNA损伤修复酶 hMSH2基因(hMSH2)、O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖蛋白激酶复合物催化亚基(DNA-PKcs)的 mRNA表达水平的影响。
　　方法:生长良好的人胚肝细胞,取4组浓度的nano-TiO2(0、0.01、0.1、1mg/L)×4组浓度的CdCl2(0、0.001、0.01、0.1μmol/L)共16组受试物进行实验。L-02细胞处理时间为24h,运用碱性和中性两种彗星试验检测各组DNA断裂损伤程度,对各染毒组进行体外微核试验计算其微核率的改变,用RT-PCR半定量DNA损伤相关基因hMSH2基因(hMSH2)、O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖蛋白激酶复合物催化亚基(DNA-PKcs)的mRNA表达水平。
　　结果:碱性彗星实验中,各浓度的nano-TiO2均不能引起DNA链断裂增加(P>0.05),各浓度的CdCl2单独作用均可以引起DNA断裂损伤(P<0.05),二者联合作用可促进DNA链断裂损伤作用,析因分析结果显示两种受试物混和染毒存在协同效应(P<0.001);在中性彗星试验中,各剂量nano-TiO2和CdCl2单独作用于L-02细胞,其DNA损伤作用与阴性剂量比较无显著性差异(P>0.05),除浓度为0.1μmol/l的CdCl2与0.1、1 mg/Lnano-TiO2联合染毒能引起DNA的损伤外,其余各组Olive尾矩均无明显变化,析因分析结果显示二者混合染毒不存在协同作用;各浓度的nano-TiO2均不能引起微核率增加(P>0.05),浓度为0.1μmol/L的CdCl2作用于L-02细胞微核率明显增加(P<0.05)通过二因子析因分析,二者混合染毒不存在协同作用;RT-PCR结果显示:各实验组 MGMT的表达水平均无明显的变化(P>0.05)。浓度为1mg/L的nano-TiO2单独作用于L-02细胞时,hMSH2的表达水平升高(P<0.05),各剂量的CdCl2作用于L-02细胞时,hMSH2的先降低,至CdCl2的浓度为0.01μmol/L时最低(P<0.05),然后表达升高,至CdCl2的浓度为0.1μmol/L时,hMSH2的表达显著性升高(P<0.05),通过二因子析因分析,二者混合染毒存在协同作用(P<0.001);各剂量nano-TiO2单独作用于L-02细胞时不会引起DNA-PKcs的表达水平的升高,浓度为0.1μmol/L的CdCl2合染毒引起DNA-PKcs的表达水平的升高(P<0.05),通过二因子析因分析,二者混合染毒无协同作用。
　　结论: CdCl2和nano-TiO2联合作用可协同增加各自对L-02细胞DNA单链断裂水平的影响,对细胞的损伤作用增大。DNA错配修复基因hMSH2和双链DNA断裂修复基因DNA-PKcs参与DNA损伤与修复过程。

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前言

第一部分 氯化镉联合纳米二氧化钛诱导人胚肝细胞脂质过氧化和凋亡的作用

1 材料与方法

1.1 试剂

1.2 主要试剂的配制

1.3 细胞培养及细胞处理

1.4 细胞存活率检测

1.5 ROS水平的测定

1.6 L-02细胞内MDA、CAT和SOD含量的测定

1.7 流式细胞仪对细胞凋亡的检测[6]

1.8 统计学分析

2 结果分析

2.1 不同浓度的nano-TiO2和CdCl2对L-02细胞存活率的影响

2.2 不同浓度的CdCl2与nano-TiO2对于L-02细胞ROS含量的影响

2.3 不同浓度的CdCl2与nano-TiO2对SOD、CAT的活力和MDA含量的影响

2.4 不同浓度的CdCl2和nano-TiO2在体外实验中对L-02细胞凋亡率的影响

2.5 MDA含量、ROS生成量与凋亡率的关系

3 讨 论

参考文献

第二部分 氯化镉与纳米二氧化钛联合作用对人胚肝细胞DNA损伤和修复的影响

1 材料和方法

1.1 主要设备和试剂

1.2 主要溶液的配制

1.3 L-02细胞的培养 (见第一部分）

1.4 L-02细胞染毒处理 (见第一部分）

1.5 单细胞凝胶电泳[6]

1.6 微核试验

1.7 RT-PCR检测hMSH2基因、MGMT和DNA-PKcs的mRNA表达[7,8,9]

1.8 琼脂糖凝胶电泳

1.9 统计分析

2 结 果

2.1 不同浓度镉与纳米二氧化钛的DNA损伤水平（碱性彗星试验）

2.2 不同浓度镉与纳米二氧化钛的DNA损伤水平（中性彗星试验）

2.3 不同浓度镉与纳米二氧化钛的染色体损伤水平（微核试验）

2.4 不同浓度镉与纳米二氧化钛的基因表达水平（RT-PCR）

3 讨 论

参考文献

全文结论

综述

附录 攻读硕士期间发表的论文

致谢