汞和铅对大鼠三叉神经元电压依赖性钙通道及胞内游离钙离子浓度的作用

摘要

目的:汞和铅都是传统的工业毒物,对机体具有急慢性毒性作用,其中神经系统是遭受损害的主要系统之一,但其神经毒性机制仍不甚明了。钙离子通道是神经细胞重要的功能蛋白,也可能是汞和铅等重金属的毒作用靶位点,因此本研究以体外培养大鼠三叉神经细胞为对象,观察汞和铅对大鼠三叉神经细胞膜电压依赖性钙通道电流及胞内游离钙离子浓度的影响,探讨工业毒物汞和铅对三叉神经细胞的毒性作用机制及特点。
　　方法:原代培养大鼠三叉神经细胞。未经染毒处理的细胞为阴性对照组,0.01、0.1、1.0、10μmol/L Hg2+和 Pb2+染毒处理的细胞为实验组。通过全细胞膜片钳技术记录不同剂量的Hg2+和Pb2+对三叉神经细胞膜电压依赖性钙通道的作用。用激光共聚焦显微镜和FLUO-3/AM荧光探针技术,从单个细胞水平检测Hg2+和Pb2+对三叉神经细胞内游离Ca2+浓度瞬间动态变化的影响。
　　结果:①0.01、0.1、1.0、10μmol/L Hg2+可使三叉神经细胞HVA ICa电流幅值分别减少(7.62±3.97)％,(19.08±7.24)%,(42.66±6.15)%和(59.01±11.84)%,与对照相比这种降低有统计学意义(P<0.05),染毒5min抑制作用达最大效应,洗脱未见明显电流恢复。不同浓度Hg2+对HVA ICa电流的激活曲线的影响为,对照组:V0.5=-5.66±1.10,k=4.93±0.93;0.01μmol/L Hg2+:V0.5=-3.43±1.57,k=3.98±1.17;0.1μmol/L Hg2+:V0.5=-1.94±1.46,k=3.46±1.38;1.0μmol/L Hg2+:V0.5=-0.84±1.87,k=4.16±1.89,P=0.0401,R2=0.9851,随着Hg2+浓度的增加,激活曲线右移,表明激活电压随Hg2+浓度的增加而增大,即通道不易被激活;但k值变化不大,表明通道一旦激活其激活速度不发生明显改变。0.01、0.1、1.0μmol/L Hg2+可使三叉神经细胞游离Ca2+浓度瞬时增加(2.50±0.83)%,(82.81±35.36)%和(222.70±62.48)%;预先用10μmol/L nifedipine处理细胞10min,可在一定程度上减弱Hg2+的升钙作用并延缓升钙的时间。②Pb2+在0.01~1.0μmol/L范围内剂量依赖性地抑制培养的三叉神经细胞HVA ICa电流,给药5min之内抑制作用即可达最大效应。0.01、0.10、1.0μmol/L Pb2+可使三叉神经细胞ICa电流幅值分别减少(13.8±2.3)%,(29.6±5.2)%和(83.4±7.06)%,与对照组相比这种降低有统计学意义(P<0.05),用细胞外液冲洗,可见电流部分恢复。0.1μmol/L Pb2+使HVA ICa激活曲线右移,V0.5=-9.66±0.34,k=4.04±0.39,P<0.05,激活电压阈值增大,激活速度变慢。0.01、0.1、1.0μmol/L Pb2+可使三叉神经细胞内[Ca2+]i分别增加(38.95±9.64)%,(143.30±44.07)%和(182.26±56.43)%。预先用10μmol/L nifedipine处理细胞10min,可在一定程度上减弱Hg2+的升钙作用并延缓升钙的时间。
　　结论:金属毒物Hg2+和Pb2+均能剂量依赖性的抑制神经细胞膜电压依赖性钙电流,并使细胞内游离钙离子浓度增加。Pb2+对细胞膜钙电流的抑制作用较Hg2+强,且在低浓度(0.01,0.1μmol/L)范围内Pb2+的升钙作用更为明显。Hg2+和Pb2+导致神经细胞内游离Ca2+浓度升高以及电压依赖性钙通道活性受抑制这两种似乎相反的作用,提示Ca2+浓度的调节是一复杂的信号过程,存在HVA钙通道以外的其他信号途径,如细胞内钙库钙离子释放或膜钙相关信号分子激活等,尚需进一步验证。
　　本实验发现金属毒物Hg2+和Pb2+均能通过影响HVA钙通道和钙信号转导过程发挥其神经毒性,这种毒性作用造成的胞内“钙超载”是神经细胞损伤的重要分子机制。其他二价工业金属毒物是否也存在类似的毒作用机制,还需进一步实验验证。

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前言

第一部分汞对大鼠三叉神经节电压依赖性钙通道及胞内游离钙离子浓度影响

1. 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.2 动物

1.3 三叉神经细胞原代培养

1.4 实验分组

1.5 膜片钳电生理记录

1.6 激光共聚焦显微镜(LSCM)测定细胞内Ca2+动态变化

1.7 资料统计分析

2. 结果

2.1 大鼠三叉神经L型钙通道电流实验质量控制

2.2 大鼠三叉神经L型钙通道电流特性

2.3 不同浓度的Hg2+对三叉神经细胞电压依赖性钙通道电流的影响

第二部分铅对大鼠三叉神经节电压依赖性钙通道及胞内游离钙离子浓度影响

1. 材料和方法

1.1 仪器和试剂

1.2 动物：

1.3 大鼠三叉神经细胞原代培养

1.4 膜片钳电生理记录

1.5 激光共聚焦显微镜LSCM测定细胞内Ca2+动态变化：

1.6 资料分析和统计

2. 结果

2.1 铅对三叉神经细胞电压依赖性钙通道的影响

2.2 铅对三叉神经细胞[Ca2+]i的影响

2.3 铅和汞对三叉神经细胞电压依赖性钙离子通道的影响的比较

3. 讨论

总结

参考文献

汞的神经毒性及作用机制研究进展

参考文献

致谢