大鼠凝血因子ⅦEGF1片段生物功能的体外研究

摘要

第一部分、脂多糖诱导大鼠主动脉内皮细胞表达组织因子的体外研究。 目的：选择最佳浓度的脂多糖（LPS）诱导大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)表达组织因子（TF），并观察TF 表达变化，找出TF表达最强的作用时间,从而建立高度表达TF的RAECs受损模型。 方法：将0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL和100μg/mL LPS分别作用RAECs6,12，24,48小时，应用MTT比色法检测细胞活力，选择最佳浓度LPS作用RAECs 不同时间，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测RAECs内TFmRNA水平，并应用免疫组织化学法和Western blotting法检测RAECs内TF蛋白水平。 结果：24 小时内，浓度为0.1μg/mL和1μg/mL LPS对细胞活力影响与阴性对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。1μg/mL LPS能显著上调RAECsTFmRNA 水平和蛋白水平，2h左右TFmRNA表达最强，4h左右TF蛋白表达最强,以后表达逐渐下降至正常水平。 结论：24小时内，0.1μg/mL和1μg/mL LPS对RAECs细胞活力无明显影响，1μg/mLLPS作用RAECs2h左右TFmRNA表达最强，4h左右TF蛋白表达最强。 第二部分、大鼠凝血因子EGF1 Ⅶ片段生物功能的体外研究。 目的：探讨大鼠凝血因子Ⅶ（rFⅦ）EGF1片段与脂多糖(LPS)诱导后高度表达TF的大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)的结合能力及其凝血活性。方法：将1μg/mL LPS作用RAECs4h,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L的rF EGF1 Ⅶ多肽与LPS诱导后的RAECs的结合能力，流式细胞仪检测10μg/mL小鼠凝血因子Ⅶ（mFⅦ）与8μmol/L rF E Ⅶ GF1多肽竞争性结合TF的能力。应用全自动凝血仪检测rF EGF1 Ⅶ多肽的凝血活性。 结果：与阴性对照组相比，4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L rF EGF1 Ⅶ多肽结合LPS诱导后的RAECs显著增多（P<0.05），而且10μg/mLmFⅦ能显著减少8μmol/LrF EGF1 Ⅶ多肽结合到高度表达TF的RAECs 上。rF EGF1 Ⅶ多肽与正常SD大鼠血清组比较，凝血酶原时间明显延长（P<0.01），而与生理盐水组比较，差异无统计学意义（（P>0.05）。 结论：rF EGF1 Ⅶ片段能结合LPS诱导后的高度表达TF的RAECs，而且它没有凝血活性。 第三部分、比较三种分离大鼠主动脉内皮细胞方法的研究。 目的：建立一种有效的、重复性好的分离RAECs的方法。 方法：采用酶消化法、瞬间热处理植环法和植块法分离RAECs，并进行培养、纯化和传代,观察细胞生长和形态，用免疫组织化学法检验VonVillebrand Factor/ Ⅷ因子相关抗原进行内皮细胞鉴定。 结果：采用植块法分离RAECs，3－5天后可见细胞贴壁生长，14天呈单层铺路石样分布，免疫组织化学法检验VonVillebrand Factor/ Ⅷ因子相关抗原，阳性细胞胞浆呈棕黄色，所占比率为(52.3±1.06)％，用其他两种方法分离后未见明显细胞贴壁生长。 结论：比较酶消化法和瞬间热处理植环法,植块法分离RAECs较简便,减少细胞污染和损伤，而且重复性好。