小鼠宫颈原位癌模型的建立及PTD4-GFP对其透膜效应的研究

摘要

鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)是一种类型独特的环状单链(负链)DNA病毒,它可编码3种蛋白:VP1、VP2及VP3。而VP3(Apoptin,亦称凋亡素)是功能蛋白,对正常二倍体细胞无杀伤作用,仅诱导具有致瘤表型细胞或转化表型细胞的凋亡,因此VP3在肿瘤的生物治疗上具有巨大的潜力和广阔的前景。但VP3为大分子物质,不能自由穿透细胞膜,这点限制了其在生物治疗上的应用。
　　1988年Green和Frankel各自独立发现HIV-TAT(human immunodeficiency virustrans-activator of transcription,HIV-TAT)蛋白具有穿透生物膜的能力,TAT蛋白具有生物穿透能力的区域称为蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD),大量的研究表明PTD具有强大的运载潜能,它能携带生物大分子进入细胞内,并发挥生物学活性,而且没有细胞选择性。
　　于是设想利用PTD强大的透膜效应,将VP3导入到肿瘤细胞中,诱导肿瘤细胞的凋亡,从而达到治疗肿瘤的目的。本实验室前期已经对VP3在体外肿瘤细胞中的凋亡做了研究,VP3在体内肿瘤中诱导凋亡的性质有待进一步研究。本课题拟以粘膜上皮类肿瘤宫颈癌为研究对象,初步探索VP3在体内肿瘤中的特性,为以后VP3的生物治疗奠定基础。本实验通过探索建立小鼠原位宫颈癌稳定模型的方法及条件,并通过构建PTD4-GFP融合蛋白的原核表达载体,经透膜实验在激光共聚焦显微镜下观察PTD4介导的融合蛋白在体内宫颈癌组织中的透膜效应,进一步验证PTD4具有携带生物大分子进入肿瘤胞内的透膜效应。结果显示:直接将U14细胞注射到小鼠宫颈粘膜下,所得到的动物模型较稳定;PTD4-GFP融合蛋白在3h后即可透过肿瘤组织进入到瘤体中。结论:直接将细胞悬液注射到小鼠宫颈粘膜下可得到稳定的动物模型;PTD4能携带GFP蛋白穿透细胞膜,具有强大的转运和透膜功能,为后期进一步研究VP3的凋亡机制及其抗肿瘤治疗奠定了基础。

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前言

材料和方法

1. 实验材料

2. 实验方法

结果

1. 小鼠宫颈原位癌模型的成瘤情况

2.重组质粒酶切电泳结果

3. 融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果（图11）

4. 荷瘤昆明小鼠涂抹融合蛋白三小时后荧光显微镜下的结果

讨论

小结

参考文献

综述

致谢