白藜芦醇改善高脂喂养大鼠胰岛素抵抗和肝脏脂毒性机制的研究

摘要

本研究分为四部分： 第一部分、大鼠正糖-高胰岛素钳夹术的改进 目的：在经典正糖-高胰岛素钳夹术基础上对插管技术进行改进，利用尾动静脉插管技术实施清醒状态下大鼠高胰岛素-正糖钳夹实验并对该技术进行评价。 方法：正常喂养和高脂喂养Wistar大鼠各5只，喂养4周后，清醒状态下鼠尾根局部麻醉，分别尾动静脉插管，由尾静脉输入胰岛素(速度O 25u/kg·h)和葡萄糖，尾动脉采血，进行高胰岛素-正糖钳夹实验。 结果：尾动静脉插管术后大鼠血糖在正常范围内，术后血糖无明显波动；高脂喂养组大鼠的葡萄糖输注率显著低于对照组(P<0.01)，表明高脂喂养的大鼠有胰岛素抵抗。 结论：尾动静脉插管技术基础上的高胰岛素-正糖钳夹实验是可行的，较传统插管技术，具有简便易行、缩短实验周期、大鼠死亡率低的优点。 第二部分、白藜芦醇改善高脂喂养大鼠胰岛素抵抗、脂肪肝及其机制的研究 目的：观察白藜芦醇是否能够改善高脂喂养所导致大鼠的胰岛素抵抗和非酒精性脂肪肝(NAFLD)并探讨其机制。 方法：急性实验：10只Wistar大鼠分成两组(每组5只)，对照组和白藜芦醇处理组，处理组白藜芦醇(100mg／kg.day)灌胃，对照组生理盐水灌胃，4小时后均处死，检测肝脏内AMPK磷酸化水平。慢性实验：30只Wistar大鼠平均分为3组(每组10只)：正常对照组(标准饲料喂养)，高脂组(高脂饲料喂养)，和白藜芦醇组，其中白藜芦醇组全程高脂饲料喂养，并从第7周开始用白藜芦醇干预治疗(100mg／kg.day)，各组均喂养16周。以正糖-高胰岛素钳夹技术评价大鼠IR,肝脏石蜡切片HE染色观察病理学改变，肝脏冰冻切片油红O染色观察肝细胞内脂质沉积状况，WestemBlot免疫印迹检测肝脏内AMPK磷酸化水平，RT-PCR检测肝脏固醇调节元件结合蛋白-1C(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA基因表达。 结果：急性实验结果：白藜芦醇干预组肝脏组织内AMPK磷酸化水平增高到对照组的164．2％；慢性实验结果：高脂喂养组大鼠与对照组相比，内脏脂肪指数、肝指数增高(P<0．05)，空腹胰岛素水平增高、葡萄糖输注率下降(P<0.01)，光镜下肝脏出现明显脂肪变性，肝组织内AMPK磷酸化水平降低到对照组的45．8％(P<0．01)，同时脂质合成基因SREBP-1c和FAS的mRNA表达量显著增多；白藜芦醇治疗后的大鼠，内脏脂肪含量显著下降(P<0．01)，空腹胰岛素水平降低、葡萄糖输注率明显增加(P<0.01)，光镜下的肝脏脂肪变性得到明显改善，肝组织内的AMPK磷酸化水平提高到对照组的70．2％(P<0.05)，与此同时脂质合成基因SREBP-1c和FAS的mRNA表达量降低。 结论：白藜芦醇可以在体内促进肝脏内AMPK活性；白藜芦醇治疗可以改善高脂喂养大鼠的IR同时减少肝脏内脂质沉积从而改善脂肪肝，其机制是通过激活AMPK而抑制下游脂质合成途径。 第三部分、白藜芒醇可通过激活AMPK途径减少肝细胞内脂质沉积 目的：观察白藜芦醇是否能够直接作用于肝细胞而减少肝细胞内的脂质沉积，并深入探讨其机制。 方法：HepG2细胞种植于6空板内，当细胞融合到80％单层贴壁细胞时血清饥饿过夜后，分别加入含0μM、10μM、25μM、50μM的白藜芦醇的低糖DMEM培养基孵育6小时和24小时后提取细胞蛋白检测细胞内AMPK水平；将HepG2培养于含25mmol／L葡萄糖和10mm／L的胰岛素培养基分别培养24小时诱导细胞脂肪变性模型，然后以50μM白藜芦醇浓度干预脂肪变性模型细胞24小时，提取蛋白后WesternBlot免疫印迹检测细胞内AMPK磷酸化水平；Trizol提取细胞内mRNA检测固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAs)的基因表达水平，同时油红O染色检测细胞内脂质沉积和提取细胞内脂质检测细胞内TG含量。 结果：白藜芦醇呈剂量、时司依赖性促进细胞内AMPKα磷酸化。HepG2细胞脂肪变性模型组出现明显的红色脂滴聚集(油红O染色显示)，细胞内TG含量显著高于对照组(P<0.01)，AMPK磷酸化水平降低到对照组的33 5％，SREBP-1c、FAS基因表达量分别增高到对照组的182％和167％；白藜芦醇处理组HepG2油红O染色和细胞内TG定量均显示脂肪变性得到明显改善，AMPK磷酸化水平恢复到对照组的72 6％，而SREBP-1c和FAs的基因表达量也显著下降。 结论：白藜芦醇可以在体外提高肝细胞内AMPK活性；白藜芦醇可以直接作用于肝细胞减少肝细胞内TG沉积，其机制是激活AMPK后抑制下游的SREBP-1c、FAS的基因表达进而抑制脂质合成。 第四部分、白藜芒醇改善高脂诱导胰岛素抵抗大鼠氧化应激 目的：观察白藜芦醇是否能够减轻高脂诱导IR模型大鼠体内氧化应激，并探讨氧化应激与IR关系。 方法：动物造模分组同本文第二部分，高胰岛素-正糖钳夹术检测胰岛素敏感性，试剂盒分别检测血清标本羟自由基、MDA水平和SOD活性，ELISA法检测血清TNF-α浓度。 结果：模型组大鼠血清羟自由基、MDA、TNF-α较对照组均显著增高，分别是对照组的1.2倍、2.1倍、1.69倍水平(P<0．05或者0.01)，SOD活性降低到对照组的86％(P<0．01)，且伴有胰岛素抵抗，提示模型组大鼠处于严重氧化应激和IR状态；经过白藜芦醇治疗后，羟自由基、MDA、TNF-α浓度降低，SOD活性恢复，IR也得到明显改善。 结论：IR和氧化应激关系密切，氧化应激是发生IR的重要原因之一，白藜芦醇的抗氧化应激效应是白藜芦醇改善IR的机制之一。