β淀粉样肽诱导神经细胞凋亡及Tau蛋白抗凋亡的机制

摘要

本研究分为四部分： 第一部分、Tau蛋白通过Akt 途径使细胞抵抗凋亡 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）包括两种典型的病理学特征，细胞内过度磷酸化的微管相关蛋白tau组成的神经原纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFTs）和细胞外由β-淀粉样肽（Aβ）形成的老年斑（senile plaques，SP）。 尽管AD和tau 相关疾病患者的神经元长期持续处在促凋亡的环境中，然而大多数含有NFTs的神经元不发生凋亡，而是慢性退行性变性，其中机制尚不清楚。 本研究小组最近的研究发现：tau蛋白过度磷酸化使神经细胞逃逸凋亡。本文在小鼠成神经瘤（mouse Neuroblastoma 2a，N2a）细胞中进一步探讨神经细胞逃逸凋亡的机制。结果显示：（1）在细胞中过度表达tau蛋白或其空载体（对照）并给予血清饥饿刺激后，过度表达tau蛋白的实验组细胞凋亡率明显低于对照组；细胞中过度表达的tau蛋白与caspase-3 活性片段和（或）浓缩/碎裂的细胞核不共定位。（2）tau蛋白对细胞的保护作用与其相对增高的磷酸化水平相关。（3）与对照组比，表达tau蛋白的细胞中Akt 激活，其下游凋亡相关因子FOXO3 磷酸化增强，p53和Bax 水平降低。（4）用抑制剂阻断Akt 途径后，tau蛋白的抗凋亡作用消失；（5）与不表达tau蛋白的细胞比，去血清饥饿处理组PI3K的催化亚基p110 含量显著升高，而磷酸化的调节亚基p85(p-p85)的相对水平没有明显改变。此外，本研究还发现在细胞核组分中含有tau蛋白，去血清饥饿处理使细胞核总tau蛋白和Ser396 位点磷酸化的tau蛋白含量均明显降低。上述研究结果提示：tau蛋白通过激活PI3K/Akt 途径使细胞逃逸凋亡，而PI3K的激活可能与tau蛋白核内水平降低有关。本研究部分阐述了tau蛋白抗凋亡的分子机制。 第二部分、β-淀粉样肽通过Akt/FOXO3/Bim 途径引起神经细胞凋亡 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）患者的特征性脑病理学改变之一是由β-淀粉样肽（Aβ）组成的细胞间沉积的大量老年斑（senile plaques，SP）。 大量研究报道，Aβ具有细胞毒性，可引起细胞凋亡。体内和体外实验都证明Aβ能引起机体生存通路中重要激酶Akt的活性降低。FOXO 是最近发现的一个与细胞生存与分化密切相关的转录因子。FOXO为Akt的下游底物，当Akt 激活时，使FOXO的Thr32 位磷酸化，FOXO 不发挥其转录因子的效应，避免了一些促凋亡蛋白或配体的表达，细胞凋亡减少。本研究的目的是观察Akt/FOXO 是否介导Aβ引起的细胞凋亡。结果显示：在过量表达Aβ的APPswe+PS1?9 双转基因细胞中，Akt 活性下降，FOXO3的Thr32 位磷酸化下降，促凋亡蛋白Bim的水平升高，神经细胞凋亡增多。该研究结果提示：Aβ可能通过Akt/FOXO3/Bim途径促进细胞凋亡。本研究为阐明Aβ引起神经细胞凋亡的机制提出了一条新通路。 第三部分、褪黑素阻止过氧化亚硝酸盐引起的tau蛋白过度磷酸化 在大鼠整体研究褪黑素对过氧化亚硝酸盐（peroxynitrite，PN）引起的tau蛋白过度磷酸化以及相关激酶，包括糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的影响。大鼠在双侧海马注射PN的前体SIN-1造模之前1 h，侧脑室注射褪黑素进行保护。利用免疫印迹法检测tau蛋白磷酸化以及相关激酶的改变。结果发现:(1) 注射SIN-1可引起tau蛋白在pS396位点发生过度磷酸化，同时，GSK-3β和MAPK家族中的p38被激活；(2)提前注射褪黑素则可阻止这些变化；(3) 褪黑素可改善PN所引起的氧化应激。本研究结果提示：褪黑素可能通过清除氧自由基和抑制相关激酶，阻止PN引起的tau蛋白过度磷酸化。 第四部分、脂多糖侧脑室注射对大鼠海马tau蛋白磷酸化水平的影响 目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)对大鼠海马神经细胞tau蛋白磷酸化的影响。 方法:大鼠侧脑室注射LPS(5μg和50μg)后于2，4，8 h提取海马神经细胞蛋白，利用免疫印迹法检测tau蛋白磷酸化的情况。 结果:(1) 大鼠海马神经细胞tau蛋白在LPS注射2 h时后出现过度磷酸化，之后出现去磷酸化。(2)注射LPS后出现了tau蛋白表达总量增加。 结论:LPS能引起大鼠海马神经细胞tau蛋白磷酸化水平。