八氢番茄红素合成酶基因(TaPSY2)的克隆转化及抗菌肽制备的研究

摘要

在所有植物中类胡萝卜素占着很重要的一部分，是自然界分布最广、种类最丰富的色素，在蓝细菌、藻类、动物及植物中充当着重要的生物功能。在植物中，类胡萝卜素属于光合作用的色素，它为光合作用捕获光能；在花和果实中，类胡萝卜素对颜色也起着非常重要的作用，包含了很多从黄色到红色的色素，它影响改变花色。类胡萝卜素在保护人类健康方面起着非常重要的作用，尤其是β-胡萝卜素，不仅是维生素A的前体，而且还具有预防心血管疾病、增强人体免疫力、延缓衰老和抗癌等的作用。类胡萝卜素的药用保健作用越来越引起人们的密切关注。因此，利用基因工程的手段，可以调控植物类胡萝卜素的代谢和积累，改变花色、改良果蔬品质。
　　 小麦种子中类胡萝卜素的积累决定了小麦胚乳的颜色，它是评价小麦营养品质的一个重要指标，而八氢番茄红素合成酶基因(PSY)在类胡萝卜素生物合成中是一个重要的关键酶，和胚乳中类胡萝卜素的积累密切关联。
　　 本研究主要利用RACE法从小麦中克隆了PSY基因，构建了植物表达载体，并利用农杆菌介导法将导肽tp和细菌中的八氢番茄红素合成酶基因（crtB）基因导入拟南芥，获得以下结果。
　　 1） 通过RACE技术克隆了小麦PSY基因的部分cDNA，序列长为1,150 bp，推测编码304个氨基酸，分子量大约33.9 kDa。
　　 2） 小麦的PSY基因与其它植物PSY基因高度同源,相似性在60％－90％之间。其中与水稻、玉米中PSY2的同源性最高达到90％以上，进化分析表明，PSY基因在植物进化上是高度保守的。软件分析表明我们克隆的PSY基因属于PSY2 群，我们将该基因命名为TaPSY2。
　　 3） 利用PCR技术扩增出tp和crtB基因，均连接到pMD18-T载体并经测序确定后，通过中间载体pBlue-script KS将tp和crtB基因连接起来，然后将tp和crtB基因连接到植物双元载体pBI121-napA的种子特异性启动子（napA）的后面。测序确定后将阳性质粒转化农杆菌感受态细胞EHA105，经菌液和质粒PCR分析，获得了真核表达载体pBI121-tp-crtB。
　　 4） 利用农杆菌花序浸染法将植物表达载体pBI121-tp-crtB转入拟南芥野生型Columbia（Col）中，共获得14株转基因系，并进行了萌发实验，结果表明tp-crtB基因不影响拟南芥正常的发育过程。
　　 我们还做了其它两方面的研究：
　　 1） 利用PCR技术快速制备DNA分子量标准物，DNA分子量条带分布适度、亮度清晰。制备的DNA分子量标准能满足研究和实验室的要求，和市售的相比，成本大大降低。
　　 2） 在大肠杆菌中融合表达和制备了富甘氨酸果蝇抗菌肽。