肝细胞高胆固醇负荷活化未折叠蛋白应答介导细胞凋亡损伤的研究

摘要

资料显示肝细胞胆固醇聚积可导致细胞损伤，为了探讨胆固醇负荷时肝细胞损伤作用及可能机制，我们体外检测了在胆固醇负荷条件下肝细胞的凋亡发生，未折叠蛋白应答活化，以及它们间的相关性。采用200μg/ml LDL或者200μg/ml LDL联合20μg/ml 胆固醇酯化酶ACAT抑制剂58035孵育人正常肝L02细胞24h；采用胆固醇氧化酶-胆固醇酯酶法联合高效液相色谱（HPLC）法检测胞内总胆固醇（TC），游离胆固醇（FC）和胆固醇酯（CE）的含量；RT-PCR分析UPR主要标志分子（BiP，XBP1，ATF6，ATF4，CHOP）基因mRNA表达水平；Western Blot检测BiP，ATF6表达及活化caspase-3蛋白片段的表达变化；Annexin V-FITC-PI荧光标记染色观察细胞凋亡；在LDL孵育的不同细胞组别中进一步添加3mM UPR抑制剂PBA，观察细胞凋亡及活性caspase-3的表达变化。
　　 结果发现，与对照组相比：用LDL孵育的细胞内胆固醇含量增加明显，对照组细胞FC含量为5.90±0.36μg/mg，LDL组中FC为11.17±0.35μg/mg，LDL+58035组为13.20±0.66μg/mg；LDL组中伴侣分子BiP mRNA和蛋白表达水平明显诱导上调，sXBP1和CHOP mRNA表达水平诱导增加，而LDL+58035组中它们的诱导表达增加更明显，同时还诱导上调ATF4，ATF6的表达；对照组中细胞凋亡率为1.1±0.6%，而LDL组中活化的caspase-3增加到4.8±0.21倍，细胞凋亡率上升到12.9±1.4%，LDL+58035组中活化的caspase-3增加到8.4±0.46倍，细胞凋亡率达到21.3±2.4%。进一步在LDL孵育的组别中添加UPR抑制剂PBA后分别检测细胞凋亡发生与活化caspase-3蛋白表达的变化，与对应的未加PBA的组别相比：LDL+PBA组和LDL+58035+PBA组中细胞凋亡率分别降至8.8±1.1%和14.9±1.6%，活化caspase-3蛋白表达减至对照组的2.5±0.13倍和5.7±0.35倍。以上结果表明胆固醇负荷能使L02肝细胞发生内质网应激，激活UPR，并引起细胞凋亡损伤，而活化的UPR介导了该凋亡损伤。