促红细胞生成素拮抗血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌细胞肥大的研究

摘要

本研究分为三部分：
　　 第一部分：原代乳鼠心肌细胞分离、培养、鉴定
　　 目的:探索稳定、可靠地分离、纯化和培养乳鼠心肌细胞的方法。
　　 方法:剪碎乳鼠心室肌组织，采用Ⅰ型胶原酶消化分离乳鼠心肌细胞，差速贴壁法和5-溴脱氧尿苷（5-BrdU）相结合纯化心肌细胞。采用a-actin抗体进行免疫组化鉴定心肌细胞。
　　 结果:①接种半小时后，可见部分心肌细胞贴壁；24小时后可见部分单个的心肌细胞搏动；48小时后可见大部分心肌细胞相互连接，成簇跳动。②a-actin抗体免疫组化染色后可见培养的细胞均是心肌细胞。
　　 结论:本实验室运用的培养心肌细胞的方法稳定、可靠，能成功分离出纯化的心肌细胞。
　　 第二部分：促红细胞生成素对乳鼠心肌细胞肥大及PI3K/Akt-eNOS信号转导通路的影响
　　 目的:探讨促红细胞生成素（EPO）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的肥大心肌细胞的影响，以及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）-内皮型一氧化氮合酶（eNOS）信号转导通路在其中的作用。
　　 方法:分离乳鼠心肌细胞，利用AngⅡ诱导建立心肌细胞肥大模型，以心肌细胞表面积和心钠素（ANF）mRNA表达作为心肌细胞肥大观察指标。观察不同浓度EPO对肥大心肌细胞的影响，并利用PI3k抑制剂LY294002和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME对其相关机制进行探讨，同时对细胞培养液中一氧化氮（NO）浓度进行检测，蛋白免疫印迹法检测磷酸化Akt（p-Akt）、Akt、磷酸化eNOS（p-eNOS）和eNOS蛋白表达情况。
　　 结果: 20 U/ml EPO能抑制由AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，表现为心肌细胞表面积和ANF mRNA表达均减少（P<0.05）。EPO能激活Akt，促进eNOS及p-eNOS表达增加（均P<0.05），并使NO合成增加（P<0.01）。LY294002和L-NAME能逆转EPO的抗心肌细胞肥大作用，减少NO产量（P<0.05）。蛋白免疫印迹法检测显示，LY294002能够抑制EPO对p-Akt、p-eNOS和eNOS蛋白表达的促进作用，而L-NAME能抑制eNOS的磷酸化（均P<0.05）。
　　 结论: EPO能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，该作用可能是通过激活PI3K/Akt信号转导通路，促进eNOS表达与活化，从而促进NO的合成来实现的。
　　 第三部分：TGF-β1-Smad2信号通路在促红细胞生成素抑制心肌细胞肥大中的作用
　　 目的:探讨TGF-β1-Smad2信号转导通路在促红细胞生成素（EPO）抗乳鼠心肌细胞肥大中的作用。
　　 方法:体外分离培养乳鼠心肌细胞，采用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激建立肥大心肌细胞模型，实验分为对照组、单纯AngⅡ刺激组、EPO（U/ml）干预组，以细胞表面积和心钠素（ANF）mRNA表达作为细胞肥大的观察指标，采用Western blot方法检测细胞内信号分子转化生长因子β1（TGF-β1）及其下游分子信号Smad2 蛋白表达与活化（p-Smad2）情况。
　　 结果: 20U/ml的EPO能有效逆转AngⅡ诱导的心肌细胞肥大；与单纯AngⅡ刺激组比较，EPO能减弱促心肌细胞肥大信号分子TGF-β1及其下游分子信号Smad2和p-Smad2蛋白表达（均P<0.05）。
　　 结论: TGF-β1-Smad2信号转导通路参与介导EPO的抗乳鼠心肌细胞肥大作用。