五甲基槲皮素抗大鼠自体移植静脉内膜增生和AngⅡ所致心室重构的实验研究

摘要

多酚类化合物是中药和药食两用植物的重要有效成分，广泛存在于众多植物中。槲皮素属多酚类化合物，其药理作用广泛，如抗缺血再灌注损伤、抗高血压、抗氧化、抗肿瘤及抗多药耐药等。但天然的多酚类化合物由于含有多个羟基而容易被氧化，不利于提取、制备和保存。另外其生物利用度低，半衰期短、效价低等缺点也防碍了对其的研发利用。黄酮类的甲基衍生物——多甲氧基黄酮，因其多甲氧基结构而具有明显的药代动力学特点和药效动力学优势。但目前天然多甲氧基黄酮的提取工艺尚无重大突破，获得较困难，其使量少而价贵，难以进行深入研发。我们对槲皮素进行了甲基化改造，获得高纯度低价位的五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ），克服了药源的瓶颈，使我们得以深入研究PMQ的药理学特性。
　　 本实验组之前研究发现PMQ 能对抗乳鼠心肌细胞的氧化损伤；能内皮依赖性和内皮非依赖性的舒张离体血管；能对抗离体和在体的心肌缺血再灌注损伤；能抑制乳鼠心脏成纤维细胞的增值。这些发现提示PMQ对心血管系统的作用值得进一步研究。
　　 考虑到临床上行冠状动脉旁路移植术（CABG）的冠心病患者仍面临着心肌重构和静脉移植桥管新生内膜再狭窄的问题，目前仍没有有效的治疗手段，本实验尝试探索PMQ对这类疾病是否能有所益处。故本实验的目的是研究PMQ对AngⅡ诱导的心肌肥大、间质纤维化的作用及对血管平滑肌细胞增值和自体移植静脉内膜增生的影响，并探讨其可能的机制。另外，在实验中改进了成年大鼠心肌细胞分离和培养的方法及大鼠颈部自体静脉移植的连续缝合方法。
　　 第一部分：五甲基槲皮素减轻Ang Ⅱ所致大鼠心肌肥厚和细胞凋亡
　　 目的:研究五甲基槲皮素（PMQ）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）致大鼠心肌肥厚和凋亡的作用。
　　 方法:30只SD大鼠随机分为5组，试验持续21天。(1)空白组：每晨生理盐水灌胃；(2)PMQ组：每晨PMQ50mg/kg灌胃；(3)AngⅡ组：于第15天开始皮下注射AngⅡ（288μg/kg·d）；(4)PMQ+AngⅡ组：PMQ和AngⅡ处理同前；(5)溶剂+AngⅡ组：每晨溶剂灌胃，AngⅡ处理同前。于第22天处死大鼠，测量心脏指数、左心指数，real time-pcr检测BNP mRNA的表达，TUNNEL法测心肌凋亡，免疫组化测Bax、Bcl-2表达。
　　 结果:Ang Ⅱ能明显引起高血压、心肌肥厚（提高心脏指数、左心指数及BNPmRNA的表达），诱导心肌细胞凋亡及上调凋亡相关蛋白Bax表达、提高Bax/Bcl-2。PMQ能明显抑制Ang Ⅱ引起的上述改变。
　　 结论:PMQ能对抗AngⅡ引起的高血压、心肌肥厚及凋亡。
　　 第二部分：五甲基槲皮素减轻Ang Ⅱ所致大鼠心肌间质纤维化
　　 目的:研究PMQ对Ang Ⅱ所诱导的大鼠心肌间质纤维化的作用。方法:SD大鼠30只随机分为5组，试验持续21天。(1)空白组：每晨生理盐水灌胃；(2)PMQ组：每晨PMQ（50mg/kg）灌胃；(3)AngⅡ组：于第15天开始皮下注射Ang Ⅱ（288μg/kg·d）；(4)PMQ+AngⅡ组：PMQ和Ang Ⅱ处理同前；(5)溶剂+AngⅡ组：每晨溶剂灌胃，AngⅡ处理同前。第22天处死大鼠，测量心肌羟脯氨酸含量，real time-pcr检测collagenⅠ及collagen Ⅲ mRNA的表达，免疫组化测collagenⅠ、collagen Ⅲ容积分数（CVF）及其比值CVFⅠ/CVF Ⅲ。
　　 结果:AngⅡ能明显提高大鼠心肌羟脯氨酸含量，上调collagenⅠ、collagenⅢ的mRNA表达，增加collagenⅠ、Ⅲ容积分数及CVFⅠ/CVF Ⅲ比值。PMQ能显著抑制Ang Ⅱ引起的上述改变。
　　 结论:PMQ 能对抗AngⅡ引起的心肌间质纤维化。
　　 第三部分：五甲基槲皮素抑制Ang Ⅱ诱导的大鼠心肌NADPH 氧化酶mRNA表达上调
　　 目的:研究PMQ对Ang Ⅱ所诱导的大鼠心肌重构的作用机制。方法:SD大鼠30只随机分为5组，试验持续21天。(1)空白组：每晨生理盐水灌胃；(2)PMQ组：每晨PMQ（50mg/kg）灌胃；(3)AngⅡ组：于第15天开始皮下注射AngⅡ（288μg/kg·d）；(4)PMQ+Ang Ⅱ组：PMQ和Ang Ⅱ 处理同前；(5)溶剂+Ang Ⅱ组：每晨溶剂灌胃，Ang Ⅱ 处理同前。第22天处死大鼠，测量心肌SOD活力、MDA含量，real time-pcr检测NADPH oxidase 亚单位Nox2和p47 phox mRNA的表达。
　　 结果:Ang Ⅱ 能明显提高大鼠心肌NADPH oxidase 亚单位Nox2和p47 phox的mRNA表达，并降低心肌SOD活力、增加MDA含量。PMQ 能显著抑制Ang Ⅱ 引起的上述改变。
　　 结论:PMQ 能对抗Ang Ⅱ 引起的心肌重构可能与其抗氧化及下调NADPH oxidase mRNA表达有关。
　　 第四部分：五甲基槲皮素抑制Ang Ⅱ诱导的血管平滑肌增殖和NADPH氧化酶mRNA表达上调
　　 目的:研究PMQ对Ang Ⅱ诱导血管平滑肌（VSMC）增殖的作用及其机制。
　　 方法:AngII（0.1 μmol/L，24h）刺激血管平滑肌细胞增殖，同时分别给予0.1、0.3、1、3、10、30 μmol/L的PMQ 干预，用MTT法测细胞活力，用DCFH-DA 测ROS，用real-time PCR测NADPH oxidase 亚单位Nox1，p47 phox，p22 phox的mRNA表达。
　　 结果:PMQ 0.3 μmol/L开始可以显著抑制VSMC的活力并减少ROS的产生，3 μmol/L作用最强，10 μmol/L、30 μmol/L作用减弱。PMQ 同时显著抑制Nox1，p47 phox，p22 phox表达。
　　 结论:PMQ 能显著抑制Ang Ⅱ诱导的VSMC增殖，此作用可能与其抗氧化及抑制NADPH 氧化酶有关。
　　 第五部分：五甲基槲皮素抗大鼠颈部自体静脉移植物内膜增生
　　 目的:研究PMQ对大鼠自体移植静脉内膜增生的作用。
　　 方法:建立大鼠颈部自体静脉移植模型，随机分为模型对照组和给药组。对照组每晨溶剂灌胃，给药组每晨按PMQ 12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg 三个剂量分别灌胃。于28天后取材测新生内膜和中膜的厚度及面积比。
　　 结果:与对照相比，三个剂量组的PMQ均能显著减小内膜和中膜的厚度及面积比，其中50mg/kg组的效果较其他两个剂量弱。
　　 结论:PMQ有抑制自体静脉移植物新生内膜增生的作用。