HBx通过核转录因子NF-κB激活趋化因子MIG表达的机制研究

摘要

目的：
　　 1.探讨HBV是否能诱导肝细胞分泌趋化因子MIG，以及筛选HBV编码的七个蛋白中能显著影响MIG表达的蛋白。
　　 2.探讨HBx在转录水平调控MIG表达的详细分子机制，筛选出HBx激活的核转录因子。
　　 3.探讨HBx蛋白诱导的MIG是否具有趋化体外培养活化PBL的生物学功能。
　　 方法：
　　 一. HBV能否诱导肝癌细胞分泌MIG：
　　 1.将包含HBV全基因组的质粒pBlue-HBV转染肝癌细胞，RT-PCR和ELISA检测MIG表达变化。
　　 2.将包含了HBV编码的七个基因的质粒pCMV-S，pCMV-preS1，pCMV-preS2，pCMV-Hbe，pCMV-HBc，pCMV-HBx，pCMV-HBp分别转染肝癌细胞，RT-PCR和ELISA检测MIG表达变化。
　　 3.构建包含MIG全长启动子的报告基因质粒（-983/+33）MIG，与HBV七个基因质粒共转染肝癌细胞，荧光素酶技术检测MIG启动子活性变化。
　　 4.将(-983/+33)MIG与不同剂量pCMV-HBx质粒共转染肝癌细胞，荧光素酶技术检测不同剂量的HBx蛋白激活MIG基因启动子的水平。
　　 二. HBx诱导MIG表达的分子机制：
　　 1.构建系列截短的MIG启动子报告基因质粒(-495/+33)MIG，(-185/+33)MIG，(-129/+33)MIG，与pCMV-HBx共转染，荧光素酶技术分析MIG启动子活性变化。
　　 2.分别突变NF-κB两个结合位点，构建突变质粒NF-κB1 MUT，NF-κB2 MUT，与pCMV-HBx共转染，荧光素酶技术分析突变MIG启动子活性变化。
　　 3.将pCMV-HBx与 (-985/+33)MIG共转染HepG2细胞后，用不同浓度的MG-132（NF-κB抑制剂）处理细胞，检测MIG启动子活性变化。
　　 4.将NF-κB亚基p65和p50表达质粒pCMV-p65、pCMV-p50分别与(-495/+33)MIG或者NF-κB2 MUT共转染HepG2细胞，荧光素酶技术检测MIG启动子活性变化，ELISA检测MIG蛋白表达的变化。将pCMV-HBx转染HepG2细胞后不同时间点收集细胞，分别提取胞质以及核内的总蛋白，Western Blot实验检测p65在核内和核外的表达变化；另外，采用FITC标记的二抗处理和DAPI染细胞核，激光共聚焦显微镜观察p65在胞浆和核内表达变化。
　　 5.将pCMV-HBx或pCMV-tag2转染HepG2细胞后，获得细胞核抽提物，用浓度为标记探针100倍的未标记探针作为竞争剂进行竞争实验，EMSA和ChIP实验验证NF-κB是否能直接与MIG启动子上NF-κB位点结合。
　　 三.HBx诱导产生的MIG对体外培养淋巴细胞的趋化作用：
　　 1.将pCMV-HBx和空载体pCMV-Tag2分别转染HepG2细胞，48 h后分别取细胞分泌上清，通过趋化实验检测分泌产物对PBL迁移的影响。
　　 2.将pCMV-HBx转染HepG2细胞后，加入10μM MG-132处理细胞，取细胞分泌上清，通过趋化实验检测分泌产物对PBL迁移的影响。
　　 3.将pCMV-p65、pCMV-p50分别转染HepG2细胞，或将pCMV-p65、pCMV-p50共转染HepG2细胞，取细胞培养上清通过趋化实验检测各组细胞分泌产物对PBL迁移的影响。
　　 4.分别转染pCMV-Tag2、pCMV-HBx、pCMV-p65、pCMV-p50，或将pCMV-p65、pCMV-p50共转染HepG2细胞。取细胞培养上清加入10 μg抗MIG的抗体中和MIG表达，然后通过趋化实验检测各组细胞分泌产物对PBL迁移的影响。
　　 结果：
　　 一.HBV诱导肝癌细胞分泌MIG：
　　 1.与空载体组相比，转染pBlue-HBV后肝癌细胞中MIG的mRNA水平显著上调，分泌的MIG蛋白量显著增加。
　　 2.HBV七个功能蛋白S，preS1，preS2，Hbe，HBc，HBx以及P蛋白中，仅有HBx蛋白可以明显地诱导趋化因子MIG表达，S蛋白亦可以轻度激活MIG表达，其他HBV蛋白对MIG表达几乎没有任何影响。
　　 3.HBV七个功能蛋白中，仅有HBx蛋白可以明显地激活趋化因子MIG启动子活性，与空载体组相比，转染pCMV-HBx后MIG启动子活性增加3.45倍；其他蛋白对MIG基因启动子活性几乎没有任何影响。
　　 4.随着HBx蛋白表达量的增加，MIG启动子的活性随之增加。
　　 二. HBx诱导MIG表达的分子机制：
　　 1.分别以共转染空载体pCMV-Tag2和报告基因细胞内MIG启动子活性为100％，HBx蛋白激活(-985/+33)MIG的活性达3.64倍，而截短的MIG启动子(-495/+33)MIG，(-185/+33)MIG，(-129/+33)MIG活性分别达3.81，4.09，1.30倍。由于截短掉-185－-129后，HBx蛋白对MIG启动子的激活能力大大降低，因此，初步推断-185－-129位点在HBx蛋白诱导MIG表达的过程中起重要作用。
　　 2.HBx蛋白可以激活野生型MIG启动子(-495/+33)MIG的活性达3.48倍，而突变的MIG启动子NF-κB1 MUT，NF-κB2 MUT和c/eBP MUT活性分别达3.12，1.43，2.78倍。由于突变掉NF-κB2结合位点后，HBx蛋白对MIG启动子的激活能力大大降低，因此推断NF-κB2结合位点在HBx蛋白诱导MIG表达的过程中起到重要作用。
　　 3.HBx蛋白可以明显地激活MIG启动子活性，但是随着加入的MG-132量的增加，这种激活现象被明显的抑制，当MG-132的浓度增加到25 uM时，其诱导作用几乎消失。
　　 4.与空载体组相比，分别转染pCMV-p65、pCMV-p50后，MIG启动子活性分别增高2.6和3.4倍；同时转染pCMV-p65、pCMV-p50后，MIG启动子活性增高5.8倍。然而，转染pCMV-p65和pCMV-p50对突变体NF-κB2 MUT没有任何作用。转染pCMV-HBx后，随着时间延长，p65在核内的量逐渐增多，而在核外的量却逐渐减少。激光共聚焦结果显示，转染空载体pCMV-Tag细胞内NF-κB的p65亚基主要集中在细胞质中，而转染pCMV-HBx细胞内NF-κB的p65亚基由细胞质转移至细胞核内。
　　 5.EMSA结果显示，转染pCMV-HBx的样本存在迁移带，而转染空载体的样本未出现迁移带，说明转染pCMV-HBx样本中存在和标记探针结合的蛋白；用浓度为标记探针20倍或100倍的未标记探针作为竞争剂进行竞争实验时发现，转染pCMV-HBx样本 (lane 3或lane 4)的迁移带随竞争剂浓度的增加则明显减弱，说明与探针结合是特异性的；当样本转染pCMV-HBx并加MG-132处理后发现，随抑制剂浓度增加，迁移带则明显减弱，说明与探针结合的蛋白是NF-κB。ChIP实验显示，转染pCMV-HBx基因的样本，当加入p65或p50的抗体时，可以通过PCR检测到包含有NF-κB2结合位点的序列，但不加入任何抗体或者加入兔IgG对照抗体并没有检测到目的条带；而转染阴性对照质粒pCMV-tag2的样品，当加入p65或p50的抗体时，也没有检测到目的条带。
　　 三.HBx诱导产生的MIG对体外培养淋巴细胞的趋化作用：
　　 1.转染pCMV-HBx细胞上清的趋化活性是转染空载体细胞上清趋化活性的5.19倍，说明HBx诱导产物能增强对活化的人PBL的趋化活性。
　　 2.加入NF-κB的抑制剂MG-132处理细胞后，分泌上清对PBL的趋化活性由5.19倍下降至1.94倍，说明NF-κB在HBx蛋白诱导PBL迁移的过程中起着重要作用。
　　 3.与阴性对照相比，转染pCMV-p65、pCMV-p50后培养细胞上清趋化活性分别增加3.2和4.0倍，共转染pCMV-p65、pCMV-p50后培养细胞上清趋化活性增加6.9倍。由此可知，p65和p50的过表达可以增加细胞分泌产物对PBL的趋化作用。
　　 4.转染空载体pCMV-Tag2的细胞加入抗MIG抗体中和分泌的MIG后，对细胞上清对PBL的趋化能力没有影响，而转染pCMV-HBx的细胞在加入抗MIG抗体后，分泌上清对PBL的趋化能力明显地下降。转染pCMV-p65、pCMV-p50的细胞，以及共转染p65和p50蛋白真核表达质粒的细胞在加入抗MIG抗体后，分泌上清对PBL的趋化能力均明显下降。转染pCMV-HBx的细胞经MG-132处理后，再加入抗MIG抗体处理细胞，其趋化PBL的能力较加对照抗体的细胞对PBL的迁移能力下降并不明显。由此可知，诱导分泌的趋化因子MIG在PBL的迁移中起着重要作用。
　　 结论:
　　 1.HBx蛋白显著激活趋化因子MIG启动子活性，从而上调MIG mRNA和蛋白表达的量。
　　 2.HBx蛋白能激活NF-κB，使NF-κB从细胞质转移至细胞核中，进入细胞核的NF-κB可以结合在趋化因子MIG启动子上的NF-κB2结合位点上，转录激活趋化因子MIG的表达。
　　 3.HBx蛋白诱导的趋化因子MIG能趋化体外培养活化PBL。