(1)、ALDH1a2基因影响膀胱癌细胞株生物学行为的实验研究；(2)、腹腔镜前列腺癌根治术膀胱尿道吻合单针连续吻合法的临床研究

摘要

尿路上皮癌(urothelial carcinoma UC)是最常见的泌尿系肿瘤，最新的流行病学报告显示UC 分别占男性和女性恶性肿瘤发病的第五位和第十位。UC是一个多因素和多阶段的逐渐发展过程，涉及到抑癌基因的失活、癌基因的活化、细胞周期的调控失常、基因启动子的转录活化异常等遗传学或表遗传学异常等诸多方面。人类基因组有两类遗传信息，一类是提供生命必需的蛋白质模板信息，称遗传学的信息；而另一类称表遗传学的信息，是指在何时、何地、以何种方式应用上述蛋白质模板信息的指令信息。表遗传学信息状态的确定可为肿瘤的早期诊断及基因治疗提供依据。有研究结果表明，表遗传学改变多发生在肿瘤发生的早期，此时肿瘤细胞还未对人体造成实质性损害，如能在此时进行人工干预，即有可能将肿瘤扼杀在摇篮中。启动子甲基化和组蛋白乙酰化是表遗传学修饰最重要的二种机制。5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-dC)是现今最重要的DNA 甲基化转移酶(DNMT)抑制剂之一，而曲古抑菌素A（TSA）则是研究最多的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，二者的联合使用可以促使肿瘤细胞的分化并诱导肿瘤的凋亡。已有研究表明维甲酸（RA）浓度过低参与了膀胱癌的发生，使用维甲酸在治疗膀胱癌中也取得一定进展。而ALDH1a2是催化视黄醛的氧化成维甲酸关键酶之一。有研究证明人类醛脱氢酶家族中ALDH1a2基因启动子区域高甲基化可导致前列腺癌发病率升高，但在膀胱癌细胞株中仍无相关研究。我们首先对5 株膀胱癌细胞株及11例正常膀胱上皮组织的ALDH1a2 启动子甲基化状态与mRNA，蛋白表达进行相关性研究后，再采用5-aza-dC、TSA处理膀胱癌细胞株逆转其甲基化状态后，探讨对其影响进而诱导膀胱癌细胞凋亡的机制。
　　 目的：探讨ALDH1a2基因在膀胱癌细胞株的甲基化状态和表达及5-aza-dC、TSA对其影响进而诱导膀胱癌细胞凋亡的机制。
　　 方法：
　　 1. 5-aza-dC 及TSA处理膀胱癌细胞。
　　 2. 采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测五株膀胱癌细胞株（BIU-87,RT-4,253J,5637,T24）及正常膀胱上皮组织经5-aza-dC、TSA处理前后的ALDH1a2启动子甲基化。
　　 3. 采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析正常膀胱上皮组织及五株膀胱癌细胞株经5-aza-dC、TSA处理前后ALDH1a2基因mRNA的表达。
　　 4. 采用Western blot检测经5-aza-dC、TSA处理前后五株膀胱癌细胞株及正常膀胱上皮组织ALDH1a2基因蛋白的表达。
　　 5. 采用AnnexinⅤ/PI双标记法，检测经5-aza-dC、TSA处理前后的五株膀胱癌细胞株的凋亡及坏死。
　　 结果：
　　 1. 在正常膀胱上皮组织中，ALDH1a2基因启动子区CpG岛表现为低甲基化。在五株膀胱癌细胞中，ALDH1a2基因启动子区CpG岛均表现为较高的甲基化；TSA不影响ALDH1a2基因DNA 甲基化水平；应用5-Aza-dC能使ALDH1a2基因启动子区CpG 岛发生去甲基化；联合给予5-Aza-dC及TSA的作用和单独给予5-Aza-dC相似。五株膀胱癌细胞中，RT-4、253J和5637细胞与BIU-87,T24细胞不尽相同，后者启动子区CpG岛甲基化程度更高并且更容易去甲基化。
　　 2.ALDH1a2基因在正常膀胱上皮组织有表达。在五株膀胱癌细胞中均无表达；经TSA作用后也无表达；5-Aza-dC作用后，RT-4、253J和5637细胞中有较弱表达：吸光度相对值为0.168，0.146，0.153，均来源于低分化高度恶性的BIU-87，T24细胞中有稍强表达：相对值为0.342，0.402；联合作用后五株细胞均有较强表达：相对值为0.293，0.324，0.421，0.658，0.753，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 3.ALDH1a2基因蛋白在正常膀胱上皮组织有表达。在五株膀胱癌细胞中均无表达；经TSA作用后，T24细胞中有少量表达，其他四株细胞无表达；5-Aza-dC作用后，五株细胞均有表达，在T24细胞中表达较强；联合作用后五株细胞中均有较强表达。
　　 4.TSA和5-aza-dC 均可诱导膀胱癌细胞株凋亡，五株膀胱癌细胞早期凋亡与晚期凋亡及坏死的变化趋势稍有不同，前者呈直线上升趋势，早期凋亡是膀胱癌细胞株死亡的主要方式，晚期凋亡/坏死的细胞相对较弱。三个实验组的细胞凋亡率分别与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。在实验浓度下，TSA组和5-aza-dC组诱导凋亡的效果以后者稍强。差异有统计学意义(P<0.05)。使用5-aza-dC、TSA 联合作用后，细胞凋亡明显增加，与TSA组和5-aza-dc组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。
　　 结论：膀胱癌细胞系中抑癌基因ALDH1a2基因启动子甲基化可能是导致其基因功能失活的主要原因。5-Aza-dC单独作用和5-Aza-dC及TSA联合应用效果相似，均能逆转ALDH1a2基因甲基化，恢复基因表达，进而诱导膀胱癌细胞株的凋亡。