HBx基因影响HepG2细胞生物学特性及DNA修复酶hMTH1、hMYHα与hOGG1表达的实验研究

摘要

目的：
　　 (1)观察HBx基因对HepG2细胞增殖、周期和凋亡等生物学特性的影响，初步探讨细胞周期蛋白p21在其中的作用和意义。
　　 (2)观察构建的HBx转基因细胞模型HepG2/HBx中8-OHdG含量及DNA修复酶hOGG1，hMYHα,hMTH1 mRNA表达的改变，从DNA修复酶这一新的角度探讨HBx在肝细胞癌发生机制中的作用。
　　 方法：
　　 (1)以四唑蓝(MTT)比色法检测HBx转基因细胞HepG2/HBx及对照组HepG2 与HepG2/pcDNA3.1细胞(转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞)的增殖情况。
　　 (2)流式细胞术检测HepG2/HBx及对照组细胞的周期和凋亡情况，并以半定量RT-PCR检测各组细胞中细胞周期蛋白p21 mRNA的表达。
　　 (3)应用HPLC/ECD法检测稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx及其对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞中的8-OHdG的含量。
　　 (4)以β-actin为内对照，应用RT/实时PCR定量检测DNA修复酶hOGG1，hMYHα，hMTH1 mRNA在HepG2/HBx细胞，对照组HepG2细胞与空质粒对照组HepG2/pcDNA3.1细胞中的表达。
　　 结果：
　　 (1)MTT比色法显示HepG2/HBx细胞生长速度加快；流式细胞术检测发现HepG2/HBx中G0/G1期细胞比例较对照组显著减少(43.34±3.11％vs 57.69±4.28[％]，P<0.01)，S期细胞比例明显增加(28.69±1.17％vs 22.41±1.99[％]，P<0.05)，同时还发现与对照组相比其凋亡率也显著降低(1.19±0.06％vs 5.43±0.42[％]，P<0.001)。半定量RT-PCR的结果表明细胞周期蛋白p21 mRNA在HepG2/HBx细胞中的表达较对照组细胞显著降低(0.16±0.05vs 0.78±0.15，P<0.001)。
　　 (2) 8-OHdG在HepG2/HBx细胞中的含量显著高于对照组HepG2和HepG2/pDNA3.1细胞(36.5±6.25vs 8.52±1.65fmol 8-OHdG/mg DNA，P<0.05)。
　　 (3)RT/实时PCR定量检测发现DNA修复酶hMTH1在HepG2/HBx细胞中的表达显著高于HepG2和HepG2/pcDNA3.1细胞(1.213±0.100vs0.087±0.026 hMTH1/β-actin mRNA×100,P<0.05)，相反DNA修复酶hMYHα在HepG2/HBx细胞中的表达却明显低于HepG2和HepG2/pcDNA3.1细胞(0.021±0.007vs 0.099±0.041 hMYHα/β-actin mRNA×100,P<0.05)，而DNA修复酶hOGG1 mRNA在各组细胞中的表达无显著差异(p>0.05)。
　　 结论：
　　 (1)HBx基因可能具有加速HepG2细胞周期进程、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的作用,并可参与下调细胞周期蛋白p21 mRNA表达的过程。
　　 (2)HBx可能通过诱导氧化应激增加HepG2细胞内DNA氧化损伤产物8-OHdG的含量，从而上调DNA修复酶hMTH1 mRNA的表达；同时HBx可抑制hMYHα mRNA的表达，影响细胞核酸切除修复功能而参与肝细胞癌的发生和发展。