Ghrelin在肥胖发生机制中的实验研究 及临床意义探讨

摘要

基础实验部分：
　　 本研究以3T3-L1前脂肪细胞为实验对象，观察ghrelin对其增殖、分化和凋亡的影响，并探讨其可能的分子生物学机制，进而深化对ghrelin这一目前已知的唯一能够促进食欲的外周激素的认识，深化对脂肪细胞增殖、分化和凋亡分子机制的认识，并进一步为肥胖及其相关疾病的预防和治疗提供新的研究方向。
　　 第一部分：生长激素促分泌素受体-1a基因在脂肪细胞分化成熟中的作用研究
　　 目的：通过观察生长激素促分泌素受体-1a基因在3T3-L1前脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化，从而进一步探讨GHSR-1a基因在脂肪细胞分化过程中的作用。
　　 方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞，采用经典的激素鸡尾酒诱导分化法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化。在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段，采用光学显微镜观察脂肪细胞的形态学变化及细胞内脂滴的形成，通过油红O染色测定脂肪细胞分化程度及细胞内脂滴的聚积情况，采用化学比色法测定脂肪细胞中甘油三酯的总量，采用半定量逆转录-聚合酶链反应技术检测脂肪细胞中GHSR-1a基因mRNA表达水平的变化。
　　 结果：诱导分化前，3T3-L1 前脂肪细胞呈梭形的成纤维细胞形态，胞浆内无脂滴；诱导分化第4天时，脂肪细胞变大、变圆，胞浆中出现脂滴；分化第6天时，细胞进一步变大、变圆，脂滴明显增多，分布于核周围，形成“戒环”样结构，从形态上由前脂肪细胞向成熟脂肪细胞转变；分化第8天时，胞浆中更多的脂滴积聚，大多数细胞分化成熟。分化第4天时，脂肪细胞的TG总量明显升高，分化第8天时TG总量进一步升高，与前脂肪细胞和对照组相比差异均有极显著的统计学意义。同时，GHSR-1a基因mRNA低表达于3T3-L1前脂肪细胞和分化第1天的脂肪细胞，随着脂肪细胞逐渐分化成熟，分化第4天和第8天时GHSR-1a基因mRNA的表达逐渐增加，分别是前脂肪细胞的1.7倍和1.9倍，差异均有显著的统计学意义；分化第8天时GHSR-1a基因mRNA的表达分别是分化第1天和第4天的1.3倍和1.1倍，差异均有显著的统计学意义；GHSR-1a基因mRNA的表达水平除在诱导分化第0～1天和第1～4天内差异无统计学意义外，其余各时间段间表达水平差异均有显著的统计学意义。
　　 结论：经典的激素鸡尾酒诱导分化法能够诱导3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化，并且能够显著增加前脂肪细胞分化过程中甘油三酯的积累。3T3-L1前脂肪细胞分化过程中GHSR-1a基因表达逐渐上调，其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致，可能参与了脂肪细胞分化过程。
　　 第二部分：Ghrelin对前脂肪细胞增殖的作用及相关机制的研究
　　 目的：观察不同浓度ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞增殖活力的影响，进而探讨其可能的作用机制。
　　 方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞，采用MTT法检测不同浓度ghrelin对其增殖活力的影响，采用半定量RT-PCR技术检测ghrelin对前脂肪细胞c-myc和胸苷激酶基因mRNA表达水平的影响。
　　 结果：10-7～10-15mol/L ghrelin作用24h均能明显促进3T3-L1前脂肪细胞增殖，其中10-11mol/L时促增殖效应最明显，而且同一浓度ghrelin促进前脂肪细胞增殖的效应随作用时间的延长而提高；ghrelin干预后前脂肪细胞c-myc和胸苷激酶基因mRNA表达水平明显升高，与对照组相比差异均有显著的统计学意义。
　　 结论：Ghrelin能够促进3T3-L1前脂肪细胞增殖。Ghrelin可能通过增加c-myc的含量，进而引起胸苷激酶的活化，从而导致细胞周期的激活，促进细胞增殖。
　　 第三部分：Ghrelin诱导前脂肪细胞分化过程中形态学观察、甘油三酯总量变化及分化转录因子表达的研究
　　 目的：通过观察ghrelin诱导3T3-L1前脂肪细胞分化过程中的形态学变化，测定分化过程中甘油三酯在细胞中的累积情况，检测分化过程中分化转录因子的表达情况，进而探讨ghrelin诱导脂肪细胞分化的作用机制。
　　 方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞，采用经典的激素鸡尾酒诱导分化法以及ghrelin诱导其分化。在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段，采用光学显微镜观察脂肪细胞的形态学变化及细胞内脂滴的形成，通过油红O染色测定脂肪细胞分化程度及脂滴的聚积情况，采用化学比色法测定脂肪细胞TG总量，采用半定量RT-PCR技术检测脂肪细胞中过氧化物酶体增殖剂活化受体γ、CAAT/增强子结合蛋白α基因mRNA的表达情况。
　　 结果：3T3-L1前脂肪细胞呈典型的梭形，胞浆中无脂滴，形态与成纤维细胞相似。Ghrelin诱导分化第4天时，细胞形态开始变圆，仅少量细胞中出现细小的脂滴；分化第6天时，细胞变圆，体积稍变大，胞浆中脂滴增多，聚集在细胞核周围；分化第8天时，细胞明显变大、变圆，胞浆内出现明显的脂滴，脂滴分布于核周围，形成“戒环”样结构。10-11mol/L ghrelin诱导3T3-L1前脂肪细胞的分化率可达70%，而激素鸡尾酒诱导分化组为90%。诱导分化第4天时，ghrelin组脂肪细胞的TG总量明显升高，与前脂肪细胞和对照组相比差异均有极显著的统计学意义；分化第8天时，TG总量进一步升高，与前脂肪细胞、分化第4天时的脂肪细胞和对照组相比差异均有极显著的统计学意义。Ghrelin诱导分化第4天时，PPARγ基因mRNA表达水平较对照组升高，是对照组的1.77倍，差异有极显著的统计学意义；分化第8天时，PPARγ基因mRNA表达进一步升高，分别是对照组和分化第4天时的1.62倍和1.81倍，差异均有极显著的统计学意义。而ghrelin组与同分化时间点Insulin组比较，差异没有显著的统计学意义。Ghrelin诱导分化第4天时，C/EBPα基因mRNA表达水平较对照组升高，是对照组的1.44倍，差异有极显著的统计学意义；分化第8天时，C/EBPα基因mRNA表达进一步升高，分别是对照组和分化第4天时的1.44倍和2.08倍，差异均有极显著的统计学意义。而ghrelin组与同分化时间点Insulin组比较，分化第4天时差异没有显著的统计学意义，分化第8天时差异有极显著的统计学意义。
　　 结论：Ghrelin具有诱导3T3-L1前脂肪细胞分化的生物学作用，PPARγ、C/EBPα随着脂肪细胞分化的进行表达水平逐渐升高，并发挥协同作用，直至终末分化期。这提示在ghrelin诱导前脂肪细胞分化过程中，PPARγ、C/EBPα对细胞完成终末分化具有重要意义。
　　 第四部分：Ghrelin对前脂肪细胞凋亡的作用及相关机制的研究
　　 目的：通过观察不同浓度ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞凋亡率和细胞周期的影响，以及p-ERK1/2和p-Akt蛋白表达水平的变化，进而探讨ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞凋亡的作用及分子机制。
　　 方法：体外培养3T3-L1前脂肪细胞，采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞仪分析不同浓度ghrelin对3T3-L1前脂肪细胞凋亡率的影响；采用PI单染流式细胞仪检测细胞周期的构成；采用Western blot方法检测ghrelin干预后脂肪细胞p-ERK1/2和p-Akt蛋白表达水平的变化。
　　 结果：10-7～10-15mol/L ghrelin组细胞凋亡率与对照组细胞凋亡率显著降低，流式细胞仪细胞周期分析显示10-11mol/L ghrelin干预后，3T3-L1前脂肪细胞处于亚二倍体峰的细胞数明显减少，而G0/G1，S和G2/M期细胞数基本不变。10-7～10-15mol/L ghrelin均可以引起前脂肪细胞和成熟脂肪细胞ERK1/2快速而强烈的活化，然而ghrelin诱导的ERK1/2的活化在脂肪细胞分化早期虽然与对照组相比明显升高，但是与分化前和成熟脂肪细胞相比却是明显减弱的；同时在前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中，ghrelin诱导的ERK1/2的活化可早至ghrelin刺激后2min，在5～10min达到作用高峰，持续至少30min以上，然而在脂肪细胞分化早期，ERK1/2的活化持续仅不足10min。10-9～10-15mol/L ghrelin均可以引起前脂肪细胞和成熟脂肪细胞Akt的活化，同时在前脂肪细胞和成熟脂肪细胞中，ghrelin刺激30min后即可检测到p-Akt蛋白的高水平表达，并且持续高水平表达可达24h。
　　 结论：Ghrelin可以抑制3T3-L1前脂肪细胞凋亡，而ERK1/2和PI3K/Akt信号通路可能参与了ghrelin调节细胞凋亡的过程。
　　 临床实验部分：
　　 目的：检测单纯性肥胖症儿童血浆ghrelin的水平，并进一步探讨ghrelin与儿童肥胖相关指标的关系及其临床意义。
　　 方法：采用酶联免疫吸附实验方法检测肥胖组32例儿童和正常对照组35例儿童血浆ghrelin水平，同时检测各组儿童血胰岛素、甘油三酯、胆固醇水平，并分析ghrelin与胰岛素、甘油三酯、胆固醇的相关性。
　　 结论：单纯性肥胖症儿童血浆ghrelin水平降低，且与胰岛素、甘油三酯呈显著负相关，这提示ghrelin是一个反映机体营养状态的标志，并且以负反馈的模式参与对能量代谢平衡的调节。