PEG-PLGA纳米载肿瘤坏死因子(TNF)受体封闭环肽的体外功能研究长春新碱促进恶性淋巴瘤TRAF-1翻译机制的研究

摘要

本研究分为二部分：
　　 第一部分：PEG-PLGA纳米载肿瘤坏死因子受体封闭环肽在体外对TNF激活中性粒细胞功能的影响
　　 肿瘤坏死因子-a（TNF-a）是一种重要的促炎细胞因子，其异常表达与多种感染/非感染性疾病相关，TNF-a过量表达可造成严重的全身毒性反应，导致血栓、休克、低血压、组织损伤甚至死亡。
　　 TNF-a通过与细胞膜上的TNF受体结合发挥其生物学效应，TNF受体有TNFRI和TNFRII两型，TNF-a生物学效应主要由TNFRI介导，TNFRII只对TNFRI起辅助和调节作用。本实验室前期从噬菌体随机环肽库中筛选到与TNFRI结合但不启动受体后信号转导的环肽，称为“TNFR封闭肽”。
　　 但是，该肽半寿期短，极易通过肾小球滤过，故本研究与华中科技大学生命科学院药物研究所合作，将TNFR封闭肽装载到PEG-PLGA修饰的纳米载体上。通过体外实验观察纳米装载后，对TNFR封闭肽生物学活性的影响，及可否延长TNFR封闭肽的生物活性半衰期。
　　 主要研究结果如下：
　　 1 PEG-PLGA纳米载TNFR封闭环肽的体外释放生物学活性研究
　　 1.1 PEG修饰PLGA纳米可抑制单核/巨噬细胞的吞噬：
　　 利用流式细胞术证实经PEG修饰的装载了GFP的PLGA纳米载体能有效逃避单核巨噬细胞对其的吞噬作用，提示PEG-PLGA纳米装载药物有助于体内长循环。
　　 1.2 PEG-PLGA纳米载体可明显延长TNFR封闭环肽对TNF细胞毒效应的抑制活性：
　　 MTT实验证实PEG-PLGA纳米载TNFR封闭环肽释放上清可有效抑制sTNF-a细胞毒效应活性；且其活性降至一半的时间在37℃为2天，在4℃则明显延长，为5天左右。而游离TNFR封闭环肽在37℃条件下，3-6小时生物活性下降至一半，在4℃条件下，24小时其抑制活性下降一半。提示PEG-PLGA纳米可明显延长环肽的半衰期。
　　 2 PEG-PLGA纳米载TNFR封闭环肽抑制sTNF-a活化中性粒细胞的研究
　　 2.1 PEG-PLGA纳米载TNFR封闭环肽对中性粒细胞吞噬功能的影响：本研究改良了以流式细胞术检测全血中性粒细胞吞噬功能的实验。用转化了GFP的BL-21细菌代替荧光标记细菌，用Cyto-D预处理细胞作为非特异性粘附对照。并且证明改良后的实验能准确客观地检测中性粒细胞的吞噬功能。吞噬活性检测显示37℃纳米载环肽释放 6h的上清能完全抑制sTNF-α激活的中性粒细胞的吞噬功能，而同条件下游离的TNFR封闭环肽则仅有轻度的抑制活性。
　　 2.2 PEG-PLGA纳米载TNFR封闭环肽对sTNF-a诱导中性粒细胞产生氧自由基的抑制作用（NBT实验）：
　　 NBT还原实验证实 37℃ 纳米载环肽释放 6h的上清可明显阻断sTNF-a诱导的中性粒细胞呼吸爆发，而游离的TNFR封闭环肽则仅有轻度抑制活性。
　　 2.3 PEG-PLGA纳米载TNFR封闭环肽对sTNF-a诱导中性粒细胞转录IL-1βmRNA的影响：
　　 用RT-PCR技术证实37℃纳米载环肽释放 6h的上清可完全封闭sTNF-α诱导中性粒细胞IL-1βmRNA的转录，而游离TNFR封闭环肽则几乎无影响。
　　 2.4 纳米载TNF受体封闭环肽对sTNF-a刺激中性粒细胞NF-kB活化的影响：
　　 用Western blot检测NF-kB信号转导通路活化后IkB的降解。结果同样显示37℃纳米载环肽释放 6h的上清可完全抑制sTNF-α诱导中性粒细胞的IkB降解，而游离TNFR封闭环肽则仅有轻度抑制活性。
　　 上述结果表明PEG-PLGA纳米载体TNFR封闭环肽可有效阻断sTNF-α对中性粒细胞的活化作用，在到达抑制炎症的同时，使封闭环肽半衰期明显延长。为TNFR封闭环肽应用于临床，为进一步开发TNF相关的抗炎药物奠定了基础。
　　 第二部分：长春新碱促进恶性淋巴瘤TRAF-1翻译机制的研究
　　 肿瘤坏死因子受体相关因子1（Tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF1）做为TRAF家族中的一员，最开始因其能与TNFR2的胞浆段结合而为人们所认识。TRAF家族作为细胞膜受体的接头分子不仅在应激中起重要调控作用，也在凋亡中有着举足轻重的地位。目前有报导TRAF1可抑制TNF-α或TCR介导的凋亡。当TNF-α与TNFR1结合的时候，TRADD募集二级接头分子RIP1、TRAF2、TRAF5,导致了IKK复合体的激活，进而激活NF-κB。而肿瘤细胞NF-κB组成性活化，常常是导致化疗耐药的重要原因。
　　 实验证实VCR可明显刺激由前B细胞型ALL患者的骨髓血中分离得到的原代细胞中TRAF1的表达，但其并不影响TRAF1mRNA水平，提示VCR对恶性淋巴肿瘤细胞TRAF1的调节不在转录水平。文献报导VCR可抑制传统的帽子依赖性翻译，故本研究主要观察VCR是否通过IRES依赖性翻译上调TRAF1表达的，并探讨其分子机制。
　　 其主要研究结果如下：
　　 1. 长春新碱诱导的B-前细胞型ALL细胞中TRAF1蛋白表达：
　　 VCR如同TNF-α一样，可诱导B-前细型ALL患者骨髓中的淋巴细胞TRAF1的表达，该作用随VCR作用时间的延长或剂量的加大而增强。
　　 2. 长春新碱不在转录水平诱导TRAF1表达：
　　 利用RT-PCR技术证实TNF-α可诱导TRAF1 mRNA水平升高，而VCR则对TRAF1 mRNA无影响。提示VCR诱导TRAF1表达的机制不同于TNF-α，即不通过转录水平上调TRAF1的表达。
　　 3. 分析TRAF1 mRNA的5′UTR全长：
　　 TRAF1 mRNA结构内包含一段非常长的5′UTR。2个淋巴瘤细胞(Raji and HDLM)和从2个ALL病人分离的原代细胞(UPN 1 and UPN 2)均表达TRAF1的5′UTR。
　　 4. 分析TRAF1 mRNA的5’UTR的IRES活性：
　　 5’UTR的2446bp的片段人为分为3个部分（从-2446到-1587、从-1586到-573、从-572到-1），用报告基因技术证实只有-572～-1片段具有IRES活性。将-572～-1片段插入到pRL-FL双顺反子载体中，该片段具有IRES活性，可促进FL翻译；且插入发卡结构，只能阻断RL翻译，却不能阻断-572～-1片段IRES介导的FL翻译。转染Raji细胞，FL的mRNA不因插入-572到-1的片段而有所变化。上述结果提示-572～-1片断是在翻译水平促进FL表达的。
　　 5. 分段分析TRAF1 mRNA的IRES核心序列：
　　 为了确定TRAF1的5′UTR中IRES活性的核心序列。我们构建了一系列的-572～-1片段的缺失体，用报告基因技术证实IRES的核心序列位于-392～-322片段中。-392～-322片段在pGL3-basic载体内不能启动FL转录，提示-392～-322片段主要通过IRES活性调节TRAF1的翻译，而并非作为启动子调节TRAF1的转录。
　　 6. 长春新碱诱导TRAF1 IRES活性：
　　 将具有IRES活性的-392～-1片段转染Raji细胞，用报告基因分析技术证实VCR能使FL活性增强，而Dox则使FL活性降低。
　　 7. 长春新碱刺激PTB胞浆转位促进TRAF1翻译：
　　 用Western blot证实VCR可促进胞核内PTB向胞浆转位。用蛋白-RNA结合实验证实具有IRES活性的TRAF1-392～-322片段可与PTB发生特异性结合。用PTB siRNA（pSUPER/PTB）不但可显著性抑制内源性PTB的表达，且显著阻断了TRAF1的表达；将插入了IRES（-392到-1）片段的荧光报告基因质粒pRL-392-FL与pSUPER/PTB质粒共转染，PTB siRNA可明显抑制-392～-1片段对FL翻译的促进作用，进一步证实PTB可促进TRAF1的IRES依赖性翻译。
　　 终上所述，我们首次证实TRAF1mRNA的IRES元件位于-392～-322。长春新碱通过促进PTB胞浆转位，上调TRAF1的IRES依赖性翻译，进而诱导TRAF1表达，这可能与肿瘤细胞抵抗化疗相关。本项研究为进一步了解TRAF1在淋巴瘤生成和化疗抵抗中的生物学作用提供了实验依据。