金叶败毒颗粒药物血清抗人巨细胞病毒感染的体外实验研究

摘要

【目的】通过四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）法分别检测金叶败毒颗粒药物血清抗人巨细胞病毒（HCMV）感染吸附、穿入、复制三环节的活性，探讨金叶败毒颗粒抗HCMV感染的作用机制。
　　 【方法】
　　 1.细胞悬液法原代培养人胚肺成纤维细胞（Human embryonic lung fibroblast，HEL）。
　　 2.HCMV AD169毒株体外细胞培养法传毒增殖，Reed-Muench法计算病毒半数细胞感染量TCID50。
　　 3.制备金叶败毒颗粒药物血清：①将正常成年雌性日本大耳白兔按体重随机分为低、中、高剂量组和空白对照组四组，每组3只；低、中、高剂量组给药量分别为1.5g/Kg、3g/Kg、6g/Kg，相当于成人每次每公斤体重用药剂量的5倍、10倍、20倍，用温双蒸水50ml溶解药物，空白对照组给予等体积的双蒸水；②低、中、高剂量组灌服相应剂量金叶败毒颗粒，空白对照组灌服等体积的双蒸水，每天上、下午各一次，连续3天，第4天上午给药后1h、1.5h、2h、2.5h、3h于兔耳中央动脉采血，血静置2h,3000rpm离心20min,取上层淡黄色透明样血清，56℃水浴灭活30min，一次性滤器过滤除菌，-80℃低温冰箱保存备用；③使用前将所需剂量的血清从-80℃取出,37℃水浴解冻，用细胞维持液将药物血清配置为5％、10％、20％、药物血清-DMEM培养液。
　　 4.金叶败毒颗粒药物血清细胞毒性检测：将HEL细胞悬液以1×105/ml的密度接种于96孔培养板,37℃、5％ CO2培养箱培养24小时，用各组药物血清-DMEM培养液干预细胞，细胞病变法（Cytopathogenic Effect，CPE）观察细胞形态变化，MTT法检测OD值，筛选出无细胞毒性的药物血清-DMEN培养液。
　　 5.金叶败毒颗粒药物血清抗病毒活性检测：将HEL细胞悬液以1×105/ml的密度接种于96孔培养板,37℃、5％ CO2培养箱培养24小时，先后用100TCID50/100ul的HCMV AD169株100ul、筛选出的无细胞毒性的药物血清-DMEM培养液干预细胞，CPE法观察细胞形态变化，MTT法检测OD值，计算病毒抑制率，筛选出抗病毒活性最高的药物血清-DMEM培养液。
　　 6.金叶败毒颗粒药物血清对HCMV吸附、穿入、复制影响的实验研究：将HEL细胞悬液以1×105/ml的密度接种于96孔培养板,37℃、5％ CO2培养箱培养24小时，利用同步感染法（Synchronized infection assays），先后用100TCID50/100ul的HCMV AD169株100ul、抗病毒活性最高的药物血清-DMEM培养液干预细胞，CPE法观察细胞形态变化，MTT法检测OD值，计算病毒抑制率，评价金叶败毒颗粒药物血清抗HCMV感染吸附、穿入、复制三环节的活性。
　　 【结果】1.HCMV AD169毒株半数细胞感染量为10-3.4/100ul。2.金叶败毒颗粒药物血清细胞毒性检测：①低剂量组药物血清：分别在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5％、10％药物血清-DMEM培养液和1h、1.5h采血配置的20％药物血清-DMEM培养液无细胞毒性，与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p＞0.1）。②中剂量组药物血清：分别在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5％、10％药物血清-DMEM培养液和1h、1.5h采血配置的20％药物血清-DMEM培养液无细胞毒性，与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p＞0.1）。③高剂量组药物血清：分别在灌胃后1h、1.5h、2h、2.5h、3h采血配置的5％、10％药物血清-DMEM培养液和1h采血配置的20％药物血清-DMEM培养液无细胞毒性，与空白对照组药物血清比较差异无显著性意义（p＞0.1）。3.金叶败毒颗粒药物血清抗病毒活性检测：①中、高剂量组药物血清具有较高的抗HCMV作用，与病毒对照组比较差异有显著性意义（p＜0.01），中剂量组、1.5h、5％药物血清的病毒抑制率达90.90％；②随时间变化，药物血清的抗HCMV作用在1.5h、2h两个采血时相达到高峰，1.5h与2h药物血清组的抗HCMV作用相当，比较差异无显著性意义（p＞0.1）；③采血时相为1.5h、2h时，中、高两种剂量组药物血清抗HCMV的作用相当，比较差异无显著性意义（p＞0.1）；4.金叶败毒颗粒药物血清对HCMV吸附、穿入、复制影响的实验研究：金叶败毒颗粒药物血清抗HCMV感染吸附、穿入、复制三阶段的病毒抑制率分别为40.43％、37.55％、88.84％，与病毒对照组比较差异有显著性意义（p＜0.01），其中抗HCMV复制的活性最强。
　　 【结论】1.药物血清制备的最佳给药剂量为中剂量（3g/Kg），最佳采血时间为1.5h，体外反应体系中药物血清最佳稀释度为5％；2.金叶败毒颗粒药物血清具有抗HCMV感染的作用；3.金叶败毒颗粒药物血清对HCMV感染的吸附、穿入、复制三阶段均有抑制作用；4.金叶败毒颗粒药物血清抗HCMV复制的作用最强。

目录

文摘

英文文摘

声明

前 言

第一部分 人胚肺成纤维细胞原代培养

第二部分 HCMV 扩增及感染性滴度测定

第三部分 金叶败毒颗粒药物血清制备

第四部分 金叶败毒颗粒药物血清细胞毒与抗病毒实验研究

第五部分 金叶败毒颗粒药物血清对HCMV 吸附、穿入、复制影响的实验研究

参考文献

综述 人巨细胞病毒感染的免疫逃逸机制研究进展

致 谢