骨桥蛋白shRNA表达载体介导RNA干扰抑制前列腺癌PC-3细胞生长和侵袭

摘要

研究背景和目的：骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是一种分泌型钙结合的磷酸化糖蛋白。在多种高转移性的恶性肿瘤细胞和患者的血清中均有OPN的过度表达。OPN诱导肿瘤细胞的浸润和转移与基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活化密切相关，OPN通过IKK (I kappa B kinase)酶依赖的信号通道诱导NF-kB（nuclear factor kappaB）介导的MMP-2和MMP-9的活化。本研究旨在探讨OPN在人前列腺癌PC-3细胞的增殖和侵袭过程中所发挥的作用，为IKK-1和IKK-2酶在NF-kB介导的信号通道中可能的功能提供实验依据。方法：构建四种含OPN shRNA的真核表达载体，分别转染人前列腺癌PC-3细胞，然后采用半定量RT-PCR方法筛选能显著抑制OPN基因表达的重组质粒。建立稳定转染OPN shRNA重组质粒的PC-3细胞株，并且应用不同浓度的IKK抑制剂VII分别抑制IKK-1和IKK-2两种酶的活性，然后采用Real-time PCR和Western blot分别检测OPN、MMP-2和MMP-9三种mRNA和蛋白的表达水平，ELISA法检测加入OPN蛋白培养的PC-3细胞的条件培养基中MMP-2、MMP-9的浓度。流式细胞术、MTT法和Transwell实验分别检测细胞生长周期变化、细胞增殖和和侵袭能力变化。应用成瘤实验观察OPN shRNA表达载体对PC-3细胞在裸鼠体内的生长潜能的影响。结果：RT-PCR方法成功筛选出能显著抑制前列腺癌PC-3细胞中OPN表达的OPN shRNA重组质粒PGPU6/GFP/Neo-OPN2，建立了稳定传代的细胞株PCs, PC/Vect和PC/OPN2。与PCs组相比，转染重组质粒的细胞PC/OPN2中OPN、MMP-2和MMP-9三种蛋白的表达量分别下降了55.22％、51.71％和28.35％ (P<0.05)，PC/OPN2细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到明显抑制。此外，特异性地抑制IKK-2酶的活性能显著降低MMP-2和MMP-9的表达水平，而抑制IKK-1酶的活性对MMP-2和MMP-9的表达水平没有明显影响。结论：OPN shRNA表达载体介导的OPN基因沉默不仅能下调OPN的表达而且能抑制MMP-2和MMP-9的分泌，OPN shRNA对前列腺癌PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用，而且该过程与MMP-2和MMP-9两种酶的表达减少密切相关，此外，在NF-kB介导的OPN诱导 MMP-2和MMP-9 活化的过程中IKK-2酶的活性发挥了重要的作用。

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文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前 言

第一部分 骨桥蛋白shRNA表达载体的构建及筛选

第二部分 OPN shRNA表达载体介导RNA干扰抑制前列腺癌PC-3细胞生长和侵袭

第三部分 IKK酶在NF-kB介导的OPN诱导MMP-2和MMP-9活化过程中的功能

综述 骨桥蛋白与恶性肿瘤的侵袭和转移

攻读博士学位期间以第一作者发表论文目录

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