钙调蛋白抑制剂对钾离子通道的直接阻断作用和离子通道与前脂肪细胞增殖的关系

摘要

第一部分钙调蛋白抑制剂对稳定表达在HEK293细胞的钾通道（hERG、hKv1.5和Kir 2.1）的直接阻断作用研究
　　 背景和目的：N-(6-Aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide(W-7)是一种众所周知的钙调蛋白（calmodulin）抑制剂，一般被用做研究calmodulin 调节细胞内钙信号相关的通路的工具药。本课题旨在利用稳定表达hERG（Kv11.1），hKv1.5和Kir2.1 钾通道的HEK293 细胞，研究W-7是否对上述电流的直接抑制作用。比较研究了W-7 对野生型hERG 通道与三种突变型的hERG 通道的作用，以明确W-7 与hERG 通道结合的分子机制。同时也研究了另外一种钙调蛋白抑制剂（W-13）对hERG 电流以及hKv1.5和Kir 2.1 电流的作用。采用全细胞膜片钳技术记录表达于HEK293 细胞的hERG 钾电流，hKv1.5和Kir 2.1 钾电流。
　　 结果：CaM 抑制剂W-7 可以抑制hERG 钾电流，hKv1.5和Kir 2.1 电流。W-7 浓度依赖性的抑制hERG 电流，半数最大效应浓度IC50 为3.5 μM。W-7 对hERG 电流的抑制也具有电压依赖性特点，在+10 mV到+60 mV之间抑制作用更加明显。W-7 可使hERG 电流电压依赖性稳态激活和失活曲线左移，失活速度加快。电极内液给予10μM W-7 对hERG 电流产生微弱的抑制作用，弱于细胞外液给予W-7 对hERG的抑制作用。在不含EGTA的电极内液中渗透给予500nM CaM（以确保细胞内游离Ca2+维持在生理水平）对hERG 电流没有明显的作用，而且不影响细胞外液给予W-7 对hERG电流的抑制程度。hERG 钾通道S6 跨膜结构域的氨基酸突变位点Y652A和F656V，以及孔道区域突变位点S631A 可改变W-7 对hERG 通道的敏感性，W-7 对3种突变hERG 通道的半数抑制浓度（IC50s）分别为5.5 μM，9.8 μM和25.4 μM。此外W-7也可抑制hKv1.5和Kir 2.1 电流，其IC50分别为6.5 μM和13.4 μM。另外一种钙调蛋白抑制剂W-13 也可抑制hERG 电流，hKv1.5和Kir 2.1 电流，IC50分别为19.8μM,75.54μM,43.75μM。
　　 结论：以上研究结果提示钙调蛋白抑制剂W-7 可直接阻断表达于HEK293 细胞上的hERG 钾电流，hKv1.5和Kir 2.1 电流。因此在解释W-7 对离子通道的影响时需谨慎。
　　 第二部分3T3-L1 前脂肪细胞离子通道的表达以及离子通道与细胞增殖的关系
　　 背景和目的：小鼠3T3-L1 前脂肪细胞被广泛用作代谢方面的研究，然而，其细胞生理（如功能性离子通道的表达）还未被阐明。本研究主要采用全细胞膜片钳技术，RT-PCR，免疫印迹（western blot），细胞增殖检测方法来探索3T3-L1 前脂肪细胞离子通道的表达以及离子通道是否参与细胞增殖调节。
　　 结果：我们发现3T3-L1 前脂肪细胞表达三种类型的离子通道,39％的细胞可记录到中电导的钙激活的钾电流（Ca2+-activated K+current(IKCa)），15％的细胞记录到内向整流钾电流（Kir），在等渗（1T）条件下只有8％的细胞可记录到氯通道电流，而有趣的是，在低渗透压（0.8T）条件下几乎所有的细胞可记录到氯电流，提示该氯通道为容量激活的氯通道。3T3-L1 细胞所记录到的Ikir 电流可被Ba2+阻断；IKCa 电流可以被中等电导的钙激活的钾电流阻断剂clotrimazole 阻断，提示所记录到钙激活的钾电流为IKCa 电流。Icl 可以被氯通道阻断剂DIDS 阻断。RT-PCR 结果表明了3种通道mRNAs的显著表达，KCa3.1基因（IKCa），Kir2.1基因（Ikir），和Clcn3（Icl.vol）。我们采用免疫印迹的方法可检测到这三种通道蛋白的表达。MTT和3H 胸腺嘧啶渗入法检测细胞增殖结果表明，IKCa 阻断剂clotrimazole和Icl.vol 阻断剂DIDS 均可浓度依赖性的抑制3T3-L1 前脂肪细胞的增殖，clotrimazole（3μM）和DIDS（200μM）对细胞增殖的抑制率分别为(10.55±2.97％和60.98±1.79％，P<0.01 vs control)。使用特异性的RNA 干扰（short interference）序列，将KCa3.1 或Clcn3基因沉默，KCa3.1 或Clcn3siRNA（100nM）均可显著下调IKCa 或Icl.vol的mRNA和蛋白表达，并可抑制细胞增殖，最大抑制率分别为(11.29±2.5％和12.76.29±2.7％，P<0.05 vs control)。流式细胞仪分析细胞周期结果表明，clotrimazole和DIDS 均可浓度依赖性的增加G0/G1 期细胞比例，clotrimazole(3 μM)和DIDS(200 μM)可使G0/G1 期细胞停滞，分别使G0/G1 期细胞比例从对照组的50.93±1.64％增加至55.29±3.13％（P＜0.01）和70.21±4.09％(P＜0.01)，并可降低S 期的细胞比例。特异性的KCa3.1和Clcn3 siRNA 干扰序列将通道基因沉默后可得到与特异性阻断剂相似的结果，与control siRNA组相比，特异性的KCa3.1 siRNA（100nM）使G0/G1 期的细胞比例从44.38±4.5％增加至48.56±4.89％（n=3，P＜0.01），而Clcn3 siRNA（100nM）可使从G0/G1 期的细胞比例从53.64±0.68％（control siRNA）增加到60.54±0.82％（n=3，P＜0.05）。
　　 结论：这些实验结果首次表明了三种功能性的离子通道包括：中电导的钙激活的钾通道（IKCa），容量敏感的氯通道（Icl.vol）和内向整流钾通道（Kir2.1）共同存在于3T3-L1 前脂肪细胞上，其中IKCa和Icl.vol 通道可参与调节细胞增殖。

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文摘

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论文说明：缩略语

声明

第一部分钙调蛋白抑制剂对稳定表达在HEK293细胞的钾通道（hERG、hKv1.5和Kir 2.1）的直接阻断作用研究

第二部分3T3-L1 前脂肪细胞离子通道的表达以及离子通道与细胞增殖的关系研究

全文小结

综述.钙调蛋白及其靶酶对于离子通道的调节

攻读博士期间发表的论文及参加会议

致谢