新型突变mucA基因编码蛋白的亚细胞定位、对生物被膜形成的影响及其机制的探讨

摘要

目的：探讨新型突变mucA56基因编码蛋白的亚细胞定位，并观察mucA56基因对生物被膜形成的影响，探讨mucA56基因影响生物被膜形成的机制。
　　 方法：采用含NcoI和XbaI 酶切位点的引物，从Pmd18t-HR扩增mucA56基因的全长克隆到Pmf54构建Pcaq56，XbaI单酶切Ppho7载体中的碱性磷酸酶基因全长插入到Pcaq56的开放阅读框中，构建mucA56-phoA融合表达载体Pcaq57。对构建的Pcaq57载体进行PCR鉴定及序列测定，并使用碱性磷酸酶抗体验证融合蛋白的表达。将Pcaq57、Pkmg170(阴性对照质粒)、Pkmg176（阳性对照质粒）分别转化大肠杆菌和铜绿假单胞菌，划线接种在含有碱性磷酸酶作用底物BCIP的LB琼脂平板上，观察各自菌落颜色以评估碱性磷酸酶活性；从pGFPuv质粒中扩增表达增强型绿色荧光蛋白的基因全长，克隆入大肠杆菌-铜绿假单胞菌穿梭质粒（Pucp20），构建一个稳定的铜绿假单胞菌绿色荧光蛋白表达载体（Pucp20/GFPuv），采用电转化的方式将Pucp20/GFPuv导入到铜绿假单胞菌PAO1、PDO300(含经典突变mucA22基因的粘液型PAO1同源菌株）、PAOmucA56（含新型突变mucA56基因的粘液型PAO1同源菌株）中，采用改良的流动介质体外培养生物被膜，应用激光共聚焦显微镜观察生物被膜形成第1、3、5天的形态和结构；收集三者生物被膜形成第一、三、五天的生物被膜细菌，提取细菌全蛋白进行蛋白质二维电泳，找出PAO1、PAOmucA56表达水平相同而与PDO300表达水平差异的蛋白点，采用基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF MS)分析差异蛋白质。
　　 结果：对构建的融合表达载体Pcaq57进行PCR鉴定及序列测定，结果表明phoA基因正向插入到mucA56的开放阅码框中；Western Blot进一步证实了融合蛋白的表达；以上提示成功构建了mucA56-phoA融合蛋白表达载体Pcaq57。转化了Pcaq57的大肠杆菌和铜绿假单胞菌，以及转化了Pkmg170的大肠杆菌和铜绿假单胞菌，在含有碱性磷酸酶作用底物BCIP的LB琼脂平板上，均表现为白色菌落，提示为无活性的碱性磷酸酶活动。而转化了Pkmg176的大肠杆菌和铜绿假单胞菌，在含有碱性磷酸酶作用底物BCIP的LB琼脂平板上均表现为蓝色菌落，提示为有活性的碱性磷酸酶活动；激光共聚焦显微镜观察PAOmucA56、PAO1、PDO300第1、3、5天生物被膜形态，结果显示：PAOmucA56、PAO1的形成方式为水平铺散，其成熟生物被膜形态为均一的薄膜状，基质覆盖完全，PAOmucA56成熟生物被膜平均厚度约为30mm，PAO1成熟生物被膜平均厚度约为25mm；PDO300的形成方式为局部堆积，呈山丘状，成熟生物被膜具有很大的异质性，以低的基质覆盖和大的微生物菌落间隔为特点，生物被膜最高厚度约为36mm。生物被膜形成第一天、第三天、第五天的生物被膜细菌全蛋白二维电泳，PAO1和PAOmucA56表达相同而与PDO300差异表达的蛋白点分别有8个、6个、15个。29个蛋白的质谱分析结果表明，有12个蛋白的质谱分析结果可信度不高（MS﹤66）。筛选出来的17个候选蛋白中，DNA指导的RNA聚合酶b亚单位、谷氨酰胺合成酶、延长因子Tu、DNA指导的RNA聚合酶a亚单位、内肽酶Clp2、延长因子G1、热休克蛋白 HtpG、ATP依赖的Clp蛋白ATP结合亚单位 clpX、触发因子在PDO300中相对低表达，而30S核糖体蛋白S18、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰赖氨酸基乙酰转移酶、PasP、生物素羧化酶、精氨酸脱亚氨酸、鸟氨酸氨甲酰转移酶、丝氨酸羟甲基转移酶3在PDO300中相对高表达；其中clp蛋白酶家族（内肽酶Clp2和ATP依赖的Clp蛋白ATP结合亚单位 clpX）分别在第三天、第五天生物被膜细菌中有PDO300的相对低表达。
　　 结论：mucA56基因编码的产物定位在细胞质；藻酸盐可以影响生物被膜结构，而mucA56基因存在藻酸盐以外的途径影响生物被膜的形成；mucA56基因是一个多效调节基因，其调节范围涉及细菌的压力应激、藻酸盐合成等很多方面。Clp蛋白酶家族的差异表达可能是PAOmucA56生物被膜形态特殊的重要原因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分新型突变mucA56基因编码产物的亚细胞定位研究

第二部分表达增强型绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌的建立及使用激光共聚焦显微镜追踪观察铜绿假单胞菌生物被膜的形态

第三部分第三部分蛋白质成分

综 述铜绿假单胞菌藻酸盐的发病机理、生物合成与基因调节及其在生物被膜发育中的作用

附 录

致 谢