小鼠多能成体祖细胞的培养及冷冻保存

摘要

第一部分 BALB/c小鼠多能成体祖细胞的分离培养
　　 目的：建立获得大量BALB/c小鼠多能成体祖细胞（MAPC）的细胞分离和原代培养方法，为下一步获得纯化的MAPC奠定基础。
　　 方法：从BALB/c小鼠胫骨和股骨中分离得到骨髓细胞悬液，采用全骨髓差异贴壁法，在含EGF、PDGF、LIF和低血清的培养基中培养，2周后以一定比例传代，继续培养，将不同时期细胞进行Giemsa染色，观察细胞形态，通过MTT比色法比较不同周龄小鼠、原代接种密度和传代接种密度对原代MAPC生长的影响。
　　 结果：取材自3周小鼠所获得原代细胞均一性和增殖情况最好，原代接种密度在（6～12）×105/cm2，传代接种密度在（20-30）×103/cm2最有利于原代 MAPC的生长。Giemsa染色可见梭形和三角形细胞。
　　 结论：在本实验条件下，BALB/c小鼠的原代MAPC能较稳定生长和扩增，给后续MACS分选提供了大量的细胞来源。
　　 关第二部分 BALB/c小鼠多能成体祖细胞的纯化和扩增
　　 目的：获得纯化的MAPC并探索MAPC体外稳定传代扩增的培养条件，建立MAPC细胞系，为探索MAPC向生殖细胞的诱导分化潜能打下基础。
　　 方法：取传2代的骨髓细胞，磁珠阴性分选去除CD45+和Ter119+细胞，将所获目的细胞以一定密度接种，观察细胞生长情况，并绘制MAPC生长曲线。台盼蓝检测MACS分选前后细胞活力有无差异，MTT比色法比较不同接种密度对MAPC生长的影响。
　　 结果：MACS分选前后细胞活性无显著性差异（P﹥0.05），MAPC的最适接种密度为（6-10）×103/cm2，MAPC接种后1-2天处于生长停滞期，第3天进入对数增长期，约持续3天，以后进入平台期。分选后MAPC核大，胞质少，呈梭形或三角形。
　　 结论：MACS阴性分选能获得相对单一并具有良好增殖活性的MAPC。
　　 第三部分 BALB/c小鼠多能成体祖细胞的鉴定和冷冻保存
　　 目的：鉴定本实验培养的MAPC，并对MAPC的冷冻保存方法的效果进行了评价，为诱导分化实验提供足够的细胞来源。
　　 方法：流式细胞术检测MAPC表面标记CD 13、CD44和CD34的表达情况。采用文献报道的方法对MAPC进行冷冻保存，对温度稍作调整，比较冻存前后细胞活力。
　　 结果：MAPC表面CD13+、CD44-和CD34-。细胞冻存前后活力无显著性差异（P﹥0.05）。
　　 结论：全骨髓贴壁结合磁性分选是获得MAPC的有效方法，采用文献报道的冷冻方法能较好的保存MAPC，保持其生长活性。

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文摘

英文文摘

论文说明:缩略语表

声明

引 言

第一部分 BALB/c小鼠多能成体祖细胞的分离培养

第二部分BALB/c小鼠多能成体祖细胞的纯化和扩增

全文小结

参考文献

综述;干细胞向生殖细胞分化的研究进展

致 谢