细胞色素P450表氧化酶2J2基因过表达对血管紧张素Ⅱ诱导的APOE缺陷小鼠腹主动脉瘤形成的影响及机制

摘要

研究背景和目的:花生四烯酸（AA）是生物体内最为丰富的小分子物质之一，是体内多种重要活性物质的前体，主要是以酯化形式结合在细胞膜内侧的脂肪酸上。当细胞受到各种生理性或者病理性刺激时，磷脂酶A2活化并脂解细胞膜上的磷脂从而释放出释放出AA，然后自由状态的AA经过三种不同的酶途径进行代谢：环氧化酶途径，脂氧化酶途径以及细胞色素P450途径，其中细胞色素P450途径包括花生四烯酸细胞色素P450表氧化酶(CYP)和ω-羟化酶。AA通过细胞色素P450表氧化酶代谢生成四种同分异构体环氧-二十碳三烯酸(EETs)，分别为5,6-EET，8,9-EET，11,12-EET与14,15-EET。EETs主要由可溶性表氧化水解酶(sEH)代谢而生成相对应的，弱生物活性的DHET。通过抑制she的活性可以显著增强EETs的生物学作用。需要指出的是，一开始被认为是基本没有作用的DHETs在近期的研究中被证实同样发挥着重要的脂代谢调节作用。
　　 细胞色素P450表氧化酶在体内广泛分布，但是仅发现CYP2C和CYP2J在人类组织表达,且2J 家族中在人组织仅发现了2J2，其在心脏和血管内皮细胞有高表达。EETs在心血管和肾脏疾病中发挥重要作用。上述作用包括：①EETs具有强大的扩张血管和调节血压功能，机制是通过通过激活钙离子敏感的钾通道而引起血管平滑肌细胞超极化进而导致血管舒张。②EETs促进内皮细胞增殖与新生血管形成，抑制内皮细胞凋亡，其机制包括激活MAPK与PI3K/AKT/eNOS/NO信号通路，上调内皮细胞eNOS的表达。③EETs明显减轻了肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导的内皮细胞和心肌细胞凋亡，其机制至少包括抑制ERK1/2的去磷酸化和激活PI3K/AKT信号通路。④EETs具有抑制炎症功能。EETs抑制了TNF-α诱导的内皮细胞炎症粘附分子的表达，抑制炎症细胞向内皮细胞粘附，减少组织中炎症细胞浸润，这些抗炎作用至少部分是通过抑制核因子NFkB的核转位，或者说通过抑制NFkB的天然抑制物IkB的磷酸化。EETs被证实为PPARγ的配体，其激活PPARγ从而发挥重要的抗炎作用，且PPARγ的拮抗剂GW9662通过抑制EETs的抗IκBα的减少而阻断其抗炎作用。且EETs通过抑制IκBα的降解，从而抑制了高同型半胱氨酸诱导的小鼠主动脉内皮细胞基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。另外，EETs可以活化纤溶酶原激活物（tPA）从而发挥抗血小板聚集的作用。⑤EETs抑制平滑肌细胞迁移，大量研究证实EETs可以抑制转移生长因子β（TGFβ）诱导的主动脉平滑肌细胞迁移。但是EETs对平滑肌细胞增殖或者凋亡的影响还存在争议，或者说可能存在比较大的种属特异性。⑥EETs显著抑制了缺血再灌注诱导的心脏和大脑的损伤，其中至少有部分保护作用是通过抑制氧化应激而发挥的。同样，最近本实验室的研究结果表明，EETs显著抑制了小鼠糖尿病肾病的发生和进展，且EETs明显抑制了三氧化二砷（ATO）诱导的舌鳞癌细胞系TCA的凋亡，这些作用的机制至少部分包括抑制病变组织和细胞的氧化应激的产生，抑制了NADPH亚单位的表达增加，抑制过氧化氢酶（CAT）以及超氧化物歧化酶(SOD)的表达下降。
　　 抑制sEH活性以提高组织和血清中EETs的浓度，已被证实有显著的心血管保护作用：扩张血管以降低血压；抑制内皮细胞损伤和动脉粥样硬化斑块的形成；抑制血脂低密度脂蛋白LDL水平的升高；抑制缺血诱导的脑损伤和血管损伤；抑制心肌缺血再灌注损伤等等。与CYP表氧化酶过表达有同样的生物学效应。特别值得提出的是相似的作用。通过口服sEH特异性抑制剂AUDA证实sEH抑制显著的减少了血管紧张素诱导的APOE缺陷小鼠腹主动脉瘤的发生。
　　 腹主动脉瘤（AAA）是腹主动脉在其本身缺陷和病理因素作用下以局部扩张向外膨隆为表现的大血管疾病，吸烟、高血压病和动脉粥样硬化是最常见的诱发因素。在我国随着人口老龄化和饮食结构的改变，腹主动脉瘤的发病率也在迅速攀升。近年来，虽然新的降压药物与调脂药物不断应用于临床；血管内治疗技术也不断改进，但腹主动脉瘤的发病率和死亡率仍居高不下，其根本原因是腹主动脉瘤的发病机制仍未完全明了。因此，明确腹主动脉瘤的发病机制并探讨新的防治策略是当前血管性疾病研究的热点与焦点问题。
　　 越来越多的研究证实炎症与氧化应激在腹主动脉瘤的发生与发展中具有重要的作用。炎症趋化因子表达增加与局部炎症细胞浸润和氧化应激是腹主动脉瘤形成的重要启动和促进因素。最近以血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的APOE基因敲除的小鼠腹主动脉瘤为模型，围绕AAA的发生和发展进行了一系列大量研究，研究结果提示减轻局部和整体炎症明显抑制动脉瘤的发生和发展。活性氧簇（ROS）的水平增加在多种血管疾病中发挥重要作用。AngⅡ可诱导ROS的产生，ROS促进平滑肌细胞的增殖和迁移与炎症细胞的募集，促进血管内皮细胞凋亡和炎症粘附因子的表达增加，活化血管中基质金属蛋白酶（MMPs）进而导致AAA的形成。在AAA动物模型中，抑制ROS产生和MMPs活性可以阻断动脉瘤的形成和发展。
　　 平滑肌细胞是血管中层的主要效应细胞，在发生AAA的局部组织，平滑肌细胞缺失和排列紊乱尤为突出。AngⅡ可以诱导血管平滑肌细胞发生氧化应激，进而导致细胞老化和凋亡。另外，血管平滑肌细胞是细胞外基质的主要来源细胞，其大量缺失导致血管局部的细胞外基质明显减少，血管壁变薄从而发生AAA。目前研究发现，在动脉瘤局部，炎症趋化因子表达增加导致了大量淋巴巨噬细胞浸润，炎症细胞（主要是中性粒细胞）在局部释放大量的ROS，ROS激活血管平滑肌细胞并使之产生和释放大量亲环素A （CypA），CypA是重要的氧化应激诱导因子（SOXY），其诱导血管平滑肌细胞增殖与迁移，氧化应激增加，局部炎症趋化因子表达增加和炎症细胞浸润，MMPs活性增加，最终促进了AAA的形成。阻断CypA（基因水平或者药物）的表达已经证实可以明显的减少血管紧张素II诱导的AAA的发生。
　　 那么能否通过激活内源性保护机制，抑制或阻断炎症反应与氧化应激，改善内皮细胞的功能，达到预防和治疗腹主动脉瘤的目的呢？CYP表氧化酶过表达可以显著抑制TNF-α诱导的血管内皮细胞的凋亡；James Liao等报道CYP表氧化酶具有抑制炎症的作用。近来的研究发现，抑制sEH的活性可以显著抑制血管紧张素II诱导的ApoE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化与腹主动脉瘤的形成，其可能的机制是sEH抑制剂抑制了炎症介质的释放与其降脂效应。细胞色素P450表氧化酶-EETs系统不仅在维持血管内皮稳态功能与调节血管张力中具有重要的作用，而且具有抗炎、抗氧化应激的效应。那么，它能否用于预防和治疗腹主动脉瘤呢？
　　 在本实验设计中设想：通过增加表氧化酶基因的表达增加内源性EETs的水平，激活血管壁内源性保护机制，拮抗血管壁炎症反应与氧化应激的启动和进展,达到预防和治疗腹主动脉瘤的目的。由此，进行本实验去证实CYP表氧化酶2J2过表达是否可以阻止血管紧张素II诱导的ApoE基因敲除小鼠腹主动脉瘤的形成，以及CYP表氧化酶与其代谢物EETs抑制腹主动脉瘤形成的可能机制是什么。
　　 实验方法和结果实验方法：
　　 1．将CYP2J2基因克隆入重组腺相关病毒（rAAV）载体中，应用碱裂解法大量提取并硅土法纯化pXXUF1-2J2、pXX6和pXX2质粒，在293细胞中经三质粒共转染方法包装成rAAV-2J2病毒，并用同样方法包装含绿色荧光蛋白GFP的rAAV-GFP病毒，以real-time PCR方法检测病毒滴度。
　　 2．所有的实验动物操作程序均符合NIH实验动物管理与使用指南，以及中国科学院实验动物管理规范所制定的标准。8周龄雄性APOE缺陷小鼠（ApoE-/-）32只，体重20-26克，适应性喂养一周后随机分为四组：sline组（sline，8只）、AngiotensinⅡ组（AngiotensinⅡ，8只）、AngiotensinⅡ+GFP组（GFP，8只）、AngiotensinⅡ+CYP2J2组（2J2，8只）。通过小鼠颈后皮下埋置微泵的方法输注AngⅡ（1.44mg/kg/d）4周制备ApoE-/-小鼠腹主动脉瘤模型，同时制备saline组实验动物（皮下埋置输注生理盐水的微泵）。具体实验方法如下：置泵手术前4周，小鼠按照体重经尾静脉注射携带目的基因的病毒溶液1×1011p.f.u/只。分别是：GFP组给予rAAV-GFP病毒溶液，2J2组给予rAAV-2J2病毒溶液，saline组和AngiotensinⅡ组给予同等体积的生理盐水注射。病毒注射后4周施行手术：小鼠2％异氟醚吸入麻醉，然后将小鼠固定在无菌手术操作台上，腹部向下，取小鼠颈后皮肤做纵向切口，长度1cm，将已经灌注生理盐水或者血管紧张素的微泵置入小鼠皮下，然后缝合。术后将小鼠置于保温箱等待完全苏醒。置入微泵后4周，实验结束并处死实验动物，分离小鼠主动脉并拍摄照片，留取相应的血液、尿液与组织标本备用。主动脉组织一部分置于4％甲醛溶液中固定后石蜡包埋，一部分冰冻。
　　 3.各组小鼠取冰冻主动脉组织提取蛋白质行Western blot检测CYP2J2蛋白质表达水平，同时ELISA方法测小鼠血液和尿中DHET含量。
　　 4．部分血标本离心后测定血脂水平（试剂盒）。
　　 5．各组小鼠主动脉组织石蜡切片行HE染色、天狼星红（Sirius Red）染色,万吉森染色以观察主动脉组织结构变化，胶原沉积情况和分布。
　　 6．各组小鼠主动脉石蜡切片行免疫组化染色检测基质金属蛋白酶（MMP）2和MMP-9,并半定量分析表达水平。同时提取冰冻肾脏组织蛋白质行Western blot检测MMP-2和MMP-9表达水平。
　　 7．检测小鼠血清和主动脉组织中炎症相关指标和CYP2J2过表达对炎症的影响：Elisa方法检测各组小鼠血清中炎症因子的水平（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、sVCAM-1、sE-selection等等）；免疫组化染色检测主动脉组织中炎症细胞趋化因子MCP-1和巨噬细胞标志蛋白ED-1的表达；Western blot检测检测MCP-1、ED-1、VCAM-1、ICAM-1、PPARγ和IkBa的水平。
　　 8．检测小鼠血、尿和主动脉组织中氧化应激相关指标和CYP2J2过表达对氧化应激的影响：试剂盒检测各组小鼠血清中脂质氧化水平的标志物丙二醛（MDA）水平和总过氧化物歧化酶活性（SOD）；普鲁士蓝染色铁元素沉积情况；Western blot检测检测PI3K/AKT/eNOS、CAT和Mn-SOD、CuZn-SOD、CAT以及NADPH亚单位的表达水平（gp91、P47、P67）。
　　 9.免疫组化和western blot法检测CypA的表达水平以及CYP2J2过表达对CypA表达的影响。
　　 实验结果：
　　 （1）通过尾静脉注射的方法:将rAAV-2J2基因导小鼠体内，经Western Blot和ELISA等方法证实，CYP2J2可以获得在小鼠主动脉持久稳定高表达2个月之久，并且显著提高了血清中EETs水平。
　　 （2）血脂数据：血浆总胆固醇水平：血管紧张素Ⅱ组（17.1±2.3 mmol/l）小鼠的血浆总胆固醇水平高于saline组（15.9±1.6 mmol/l）小鼠，与GFP组（16.9±2.5mmol/l）相比无差异,但是2J2组小鼠的总胆固醇（11.7±1.12 mmol/l）显著低于GFP组和Angiotensin组，差异有统计学意义。血浆甘油三酯水平：血管紧张素Ⅱ组（1.88±0.33 mmol/l）小鼠的血浆甘油三酯水平高于saline组（1.74±0.16 mmol/l）小鼠，与GFP组（1.86±0.31mmol/l）相比无差异.但是2J2组小鼠的甘油三酯（1.70±0.21 mmol/l）显著低于GFP组和Angiotensin组，差异有统计学意义。高密度脂蛋白：血管紧张素Ⅱ组（0.33±0.07 mmol/l）小鼠的血浆总胆固醇水平低于saline组（0.44±0.03 mmol/l）小鼠，与GFP组（0.33±0.07 mmol/l）相比无差异.但是2J2组小鼠的总胆固醇（0.37±0.04 mmol/l）显著高于GFP组和Angiotensin组，差异有统计学意义。低密度脂蛋白：血管紧张素Ⅱ组（17.72±1.83 mmol/l）小鼠的血浆总胆固醇水平高于saline组（15.42±1.12 mmol/l）小鼠，与GFP组（17.4±1.81 mmol/l）相比无差异.但是2J2组小鼠的总胆固醇（16.36±1.45mmol/l）显著低于GFP组和AngiotensinⅡ组，差异有统计学意义。
　　 （3）CYP2J2过表达对动脉瘤的发生率以及腹主动脉直径的影响：动脉瘤的发生率：血管紧张素Ⅱ组动脉瘤发生率（75％,6/8）高于saline组（0％，0/8）小鼠，与GFP组（75％,6/8）相比无差异.但是2J2组小鼠的动脉瘤发生率（25％,2/8）显著低于GFP组和Angiotensin组，差异有统计学意义。腹主动脉直径：与saline组（0.96±0.09 mm）相比，血管紧张素慢性输注（2.3±0.35mm）明显的导致了血管直径的增大，与GFP组的主动脉直径（2.27±0.34 mm）相比无差异。然而rAAV-2J2病毒注射组的小鼠主动脉直径（1.33±0.21 mm）与Ang Ⅱ组合GFP组的小鼠相比，明显降低。
　　 （4）主动脉石蜡切片染色结果：血管紧张素Ⅱ组与GFP组小鼠腹主动脉壁层明显增厚：内膜斑块多见，不规则且增厚的中膜，明显肥厚的血管外膜，内膜下多见急性的出血点且内膜经常由隆起的斑块打断。普鲁士蓝染色在管壁的内膜和外膜可见明显的铁沉积，位置与CD68阳性的炎症细胞重叠。天狼星红染色可见GFP和血管紧张素Ⅱ组小鼠主动脉组织可见明显的结构改变和破坏，中膜和外膜大量细胞外基质的沉积，中膜的弹性胶原蛋白不连续且排列紊乱。外膜也有一定程度的增厚，主要由成纤维细胞和炎症细胞构成。Saline组小鼠的血管未见内膜下急性出血点和斑块，也未见到铁质沉积，管壁明显比血管紧张素Ⅱ组与GFP组要薄。CYP2J2组小鼠管壁也可见比较少的胶原沉积，但是胶原蛋白束大多是完整的且排列有序，外膜明显比血管紧张素Ⅱ组与GFP组薄且少见铁沉积和炎症细胞浸润。即CYP2J2过表达显著抑制了AngiotensinⅡ慢性输注导致的血管结构变化和铁沉积以及炎症细胞浸润。
　　 （5）免疫组化和western blot检测MMP-2和MMP-9表达。AngiotensinⅡ组与GFP组小鼠血管壁有大量的MMP-1和MMP-9表达，而CYP2J2过表达显著减少了MMPs的表达。Western blot的结果同样证实了这个结果。
　　 （6）炎症相关指标检测结果：ELISA方法检测小鼠血清中炎症因子的结果表明2J2过表达显著降低了GFP和AngiotensinⅡ组小鼠血清中炎症因子水平。2J2组血清IL-1β的水平(41±4.5pg/ml)明显低于GFP（64±7 pg/ml)和AngiotensinⅡ组（62±8 pg/ml)，但均高于saline组(22±2 pg/ml); 2J2组血清IL-4的水平(24.3±2.85pg/ml)明显高于GFP（19.6±3.27 pg/ml)和AngiotensinⅡ组（19.2±3.52 pg/ml)，但均高于saline组(28±1.7 pg/ml); 2J2组血清IL-6的水平(35.2±4 pg/ml)明显低于GFP（52.5±7 pg/ml)和AngiotensinⅡ组（53.5±6 pg/ml)，但均高于saline组(26.6±2 pg/ml); 2J2组血清IL-10的水平(92±11 pg/ml)明显高于GFP（62±16.5pg/ml)和AngiotensinⅡ组（63.2±15pg/ml)，但均高于saline组(138±8.4 pg/ml); 2J2组血清sVCAM-1的水平(3.72±0.384 ng/ml)明显低于GFP（4.84±0.67 ng/ml)和AngiotensinⅡ组（4.89±0.58 ng/ml)，但均高于saline组(2.45±0.22 ng/ml); 2J2组血清sE-selection的水平(39.66±4.39 ng/ml)明显低于GFP（51.71±8.27 ng/ml)和AngiotensinⅡ组（51.91±8.72 ng/ml)，但均高于saline组(23.25±3.14 ng/ml)。免疫组化检测单核巨噬细胞趋化因子（MCP-1）和巨噬细胞标志蛋白（ED-1）：与GFP组和AngiotensinⅡ组相比，2J2过表达显著减少了组织MCP-1的表达。ED-1阳性细胞占总细胞的比例分析表明，与GFP组(20.46％±4.9％，n=8)和AngiotensinⅡ组(19.7％±4.5％，n=8)相比，2J2过表达(7.9％±3.12％，n=8)显著减少了ED-1阳性细胞所占比例。
　　 Western blot结果表明，GFP组和AngiotensinⅡ组主动脉组织VCAM-1、ICAM-1和CypA的表达水平显著升高，但是PPARγ和IkBa的表达水平明显降低。2J2过表达显著抑制了上述变化。
　　 （7）检测血清、尿和肾脏组织中氧化应激相关指标：小鼠血清中MDA含量结果表明2J2组血清MDA水平（0.63±0.069 umol/l）显著低于GFP组（0.73±0.098 umol/l）和AngiotensinⅡ组（0.76±0.116 umol/l）但是高于saline组（0.46±0.05umol/l）。小鼠血清中SOD活性的结果表明，与saline组（63±3.5U/ml）相比显著下降，2J2组血清SOD活性（43±5U/ml）显著高于GFP组（31±6 U/ml）和AngiotensinⅡ组（29±7 U/ml）。小鼠主动脉组织中MDA含量的结果显示：2J2组小鼠主动脉组织MDA水平（9.17±1.40 nmol/mg protein）显著低于GFP组（13.51±1.63 nmol/mg protein）和AngiotensinⅡ组（13.46±1.74 nmol/mg protein）；小鼠主动脉组织中SOD活性的结果显示：2J2组小鼠主动脉组织SOD活性（79.20±7.16 U/mg protein）显著高于GFP组（62.20±9.89 U/mg protein）和AngiotensinⅡ组（59.20±9.96 U/mg protein）。小鼠血清中NO含量的结果显示：GFP组小鼠腹主动脉组织MDA水平（27.7±4.74 umol/l）和AngiotensinⅡ组（28.3±4.63 umol/l）小鼠主动脉组织MDA水平与saline组（45±2.03 umol/l）相比显著升高，2J2组小鼠主动脉组织MDA水平（37.17±3.10 umol/l）显著低于GFP组和AngiotensinⅡ组。尿总（Nox）排泄（Urinary NOX excretion）结果显示，GFP（0.373±0.069 umol/24h/100mg BW）和AngiotensinⅡ组（0.376±0.067 umol/24h/100mg BW）组小鼠尿总（Nox）排泄与saline组（0.592±0.032 umol/24h/100mg BW）相比显著下降，2J2组小鼠尿中一氧化氮排泄（0.468±0.048 umol/24h/100mg BW）显著高于GFP组和尿总（Nox）排泄。
　　 普鲁士蓝染色的结果表明，2J2基因过表达显著抑制了AngiotensinⅡ诱导的铁在血管组织的沉积。P47免疫组化染色的结果表明，2J2基因过表达显著抑制了AngiotensinⅡ诱导的P47在血管组织的表达。
　　 Western blot免疫印记法检测氧化应激相关蛋白（Mn-SOD、CuZn-SOD、CAT、P67 phox、P47 phox、gp91 phox、PI3K、AKT和eNOS）在小鼠主动脉组织中的表达结果显示：与saline组相比，GFP组和AngiotensinⅡ组主动脉组织氧化应激促进蛋白P67 phox、P47 phox和gp91 phox表达明显升高，而氧化应激抑制蛋白Mn-SOD、CuZn-SOD、CAT、PI3K、AKT和eNOS的表达显著降低，2J2基因过表达显著抑制了GFP组和AngiotensinⅡ组相关蛋白表达变化。
　　 （8）血管紧张素Ⅱ慢性输注显著提高了小鼠血管中CypA的表达水平，而2J2过表达明显抑制了AngⅡ诱导的CypA表达升高。
　　 统计学分析：
　　 实验数据均以mean±SD表示，统计学分析应用SPSS13.0软件，各组之间差异采用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异具有统计学意义。
　　 结论：
　　 1．重组腺相关病毒介导的CYP2J2基因转染APOE缺陷小鼠在主动脉组织获得了长期稳定高表达，并且显著提高了血液中EETs的含量。
　　 2．CYP2J2基因过表达显著抑制了Angiotensin所致的腹主动脉发生率和主动脉直径扩大。
　　 3．CYP2J2基因过表达抑制了内膜增厚和断裂，减轻了中膜肥厚的程度和弹性蛋白的断裂和排列紊乱，抑制了外膜肥厚和成纤维细胞以及炎症细胞在局部增加。且CYP2J2基因过表达明显抑制了基质金属蛋白酶（MMP2和MMP9）的上调。
　　 4．CYP2J2基因过表达显著抑制了APOE缺陷小鼠血清中炎症促进因子的水平，并明显减轻了主动脉组织炎症趋化蛋白的表达和单核巨噬细胞浸润。
　　 5．CYP2J2基因过表达显著抑制了APOE缺陷小鼠血、尿和主动脉组织中氧化应激的水平，下调了NADPH亚单位的表达、减少血和主动脉组织中MDA水平，提高血和主动脉组织中SOD水平和尿中总一氧化氮排泄。
　　 6．CYP2J2基因过表达显著抑制了血管紧张素诱导的CypA表达上调。
　　 7．本实验所取得的研究结果为将来腹主动脉瘤（AAA）的治疗提供了一个新的思路和策略，有望成为治疗AAA的一个新的作用靶点，为药物开发和基因治疗提供了新的理论依据和研究方向。

目录

文摘

英文文摘

声明

研究背景

材料和方法

实验结果

讨 论

参考文献

综 述

附录

致 谢