M3型乙酰胆碱受体功能障碍对内皮细胞屏障功能及黏着连接的影响和机制研究

摘要

第一部分M3 mAChR 抑制对内皮细胞渗透性的影响
　　 目的：本文旨在通过观察M3 型乙酰胆碱受体（mAChR）阻滞对内皮细胞渗透性的影响，探讨M3 mAChR 功能障碍在动脉粥样硬化发生和进展中的作用。
　　 方法：本实验采用免疫荧光组化法检测血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)在EA.hy926 内皮细胞上表达。通过给予M3 mAChR 激动剂氯化乙酰胆碱(1×10-6 M)或M3 mAChR 特异性阻断剂4-DAMP (1×10-6 M)，采用激光共聚焦观察细胞Ca 2+荧光强度的变化，验证EA.hy926内皮细胞是否有功能性M3 mAChR表达。通过给予M3 mAChR 特异性阻断剂4-DAMP或应用siRNA （Small interfering RNA）技术干预M3 mAChR，采用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-葡聚糖）透过Transwell 小室系统来评价内皮细胞渗透性的改变。MTT 法检测M3 mAChR 阻滞对内皮细胞活性的影响。
　　 结果：激光共聚焦下β-catenin和VE-cadherin 均匀的分布于细胞边缘，表明EA.hy926 内皮细胞表达VE-cadherin和β-catenin ；给予M3 mAChR 激动剂氯化乙酰胆碱(1×10-6 M)，Ca 2+荧光强度增强；当用M3 mAChR 特异性阻断剂4-DAMP (1×10-6M)预孵育后再给予氯化乙酰胆碱(1×10-6 M)，Ca 2+荧光强度无变化；表明EA.hy926内皮细胞有功能性M3 mAChR表达。与对照组相比，4-DAMP和M3 mAChR siRNA能够明显增加血管内皮细胞的渗透性且不伴内皮细胞活性下降。
　　 结论：M3 mAChR 功能障碍增加血管内皮细胞的渗透性。
　　 第二部分M3 mAChR 抑制对内皮细胞黏着连接蛋白的影响
　　 目的：本文旨在通过观察M3 mAChR 阻滞对内皮细胞黏着连接蛋白的影响，探讨M3 mAChR 功能障碍增加内皮细胞渗透性的机制。
　　 方法：通过给予M3 mAChR 特异性阻断剂4-DAMP或应用M3 mAChR siRNA 技术，采用免疫印迹法测定黏着连接蛋白VE-cadherin和β-catenin的表达；采用免疫共沉淀和免疫印迹法测定黏着连接蛋白VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；采用免疫印迹法测定Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin的变化，观察M3 mAChR抑制对黏着连接蛋白复合体与细胞骨架肌动蛋白之间连接的影响。采用免疫荧光组化法检测VE-cadherin和β-catenin在细胞边缘的分布情况。
　　 结果：M3 mAChR 特异性阻断剂4-DAMP (1×10-6 M; 0，15，30 min)和M3 mAChRsiRNA 显著地增加VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；降低经Triton 100-X 不溶部分（与细胞骨架相连蛋白）中VE-cadherin和β-catenin的表达；但对VE-cadherin和β-catenin的表达无影响。4-DAMP (1×10-6 M; 45min)显著下调VE-cadherin和β-catenin在细胞边缘和细胞-细胞连接处的表达。
　　 结论：M3 mAChR 抑制通过促进黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化，下调其在细胞边缘和细胞-细胞连接处的表达，同时减弱黏着连接蛋白复合体与细胞骨架肌动蛋白之间连接，从而使内皮细胞渗透性升高。
　　 第三部分 M3 mAChR 抑制通过降低PTP1B 活性介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化
　　 目的：本文旨在通过观察蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)对M3 mAChR 抑制介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化的影响，探讨其中的相关机制。
　　 方法：通过给予M3 mAChR 特异性阻断剂4-DAMP和应用PTP1B siRNA 技术，采用免疫共沉淀和免疫印迹法测定黏着连接蛋白VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；PTP1B 检测试剂盒测定PTP1B 活性变化。给予cAMP的类似物8-Br-cAMP （1×10-5M）或PKC α的活化剂PMA （1×10-7 M），研究M3 mAChR 抑制对PTP1B 活性下调的可能信号机制。
　　 结果：PTP1B 特异性siRNA 显著增加VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平。同时进一步促进4-DAMP 介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化。4-DAMP 降低PTP1B的活性，但对其表达无影响。8-Br-cAMP（1×10-5M; 10min）对PTP1B 活性无影响，但显着地抑制4-DAMP 对PTP1B 活性的下调作用；但是，PMA （1×10-7 M ；10min）对4-DAMP 介导PTP1B 活性下调无影响。
　　 结论：M3 mAChR 抑制通过降低PTP1B的活性从而介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化水平升高。M3 mAChR 抑制介导PTP1B 活性下调主要是通过信号分子cAMP 而非PKC α。
　　 第四部分IQGAP1 参与M3 mAChR 抑制下调Rac1 活性介导黏着连接复合体与细胞骨架蛋白分离
　　 目的：本文旨在通过观察M3 mAChR 抑制对Rac1 活性的影响。探讨M3 mAChR 抑制减弱黏着连接复合体与细胞骨架蛋白之间连接的相关机制。
　　 方法：本实验通过给予M3 mAChR 特异性阻断剂4-DAMP和应用IQGAP1 siRNA 技术，采用免疫印迹法测定Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达的变化，观察IQGAP1 对M3 mAChR 抑制介导黏着连接蛋白复合体与细胞骨架肌动蛋白分离的影响。采用pull-down 法检测M3 mAChR 抑制对Rac1 活性的影响。采用免疫共沉淀和免疫印迹法测定M3 mAChR 抑制对IQGAP1-Rac1 蛋白复合体与IQGAP1-β-catenin 蛋白复合体表达水平的影响。为研究NO是否参与M3 mAChR 抑制介导的黏着连接复合体与细胞骨架蛋白之间分离，给予NO 供体SNAP 预处理，用免疫印迹测定Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin的变化，用pull-down 法测定其对Rac1 活性的影响。
　　 结果：IQGAP1 特异性siRNA 减少Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达；同时进一步促进4-DAMP 介导的Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达减少；这些结果表明，IQGAP1 维持黏着连接复合体与细胞骨架蛋白之间的连接并且参与到M3 mAchR 抑制介导它们之间的分离。4-DAMP （1×10-6 M ；0，5，10，15min）降低Rac1 活性，而对Rac1 蛋白表达无影响。4-DAMP （1×10-6 M）降低Rac1-IQGAP1 复合体的水平，却增加IQGAP-β-catenin 复合体的水平；给予M3 mAChR 激动剂，氯化乙酰胆碱（1×10-8 摩尔/升）预处理，显著抑制4-DAMP 介导Rac1-IQGAP1 复合体与IQGAP-β-catenin 复合体的变化；这些结果表明抑制M3 mAChR 降低Rac1 活性使IQGAP1与Rac1分离并通过与β-catenin 相结合从而使VE-cadherin/β-catenin 复合体与细胞骨架肌动蛋白分离。NO 供体SNAP 显著抑制4-DAMP 介导的Rac1 活性下调和Triton 100-X 不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达减少，但与无干预组相比均仍有下降；表明M3 mAchR 功能障碍引起NO 减少导致VE-cadherin/β-catenin 复合体与细胞骨架肌动蛋白之间的分离以及Rac1 活性的下降,并且这一过程存在NO 非依赖性途径。
　　 结论：M3 mAChR 抑制降低Rac1 活性，使IQGAP1与Rac1分离并通过与β-catenin相结合从而使VE-cadherin/β-catenin 复合体与细胞骨架肌动蛋白分离。

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文摘

英文文摘

论文说明:缩略名词表

声明

引 言

第一部分M3 mAChR 抑制对内皮细胞渗透性的影响

第二部分M3 mAChR 抑制对内皮细胞黏着连接蛋白的影响

第三部分M3 mAChR 抑制通过降低PTP1B 活性介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化

第四部分IQGAP1 参与M3 mAChR 抑制下调Rac1 活性介导黏着连接复合体与细胞骨架蛋白之间的分离

结 论

综 述内皮细胞黏着连接研究概况及进展

附录 撰写文章

致 谢