IgA分泌细胞在IgA肾病中的分布和迁移研究

摘要

第一部分IgA 肾病小鼠模型的构建及鉴定
　　 目的：用黏膜免疫诱导法构建IgA 肾病小鼠模型，以作为后期进行IgA 肾病发病机制研究及探讨IgA 肾病的预防和治疗策略的基础。
　　 方法：采用口服牛血清白蛋白，后期联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B的方法来诱导构建IgA 肾病小鼠模型。每隔4周收集24h 尿液检测尿红细胞计数，并采用考马斯亮蓝法检测24h 尿蛋白定量。12周末处死动物，收集血液检测小鼠血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、胆固醇(CHOL)及肌酐(Cr)含量；收集肾组织标本用免疫组织化学法检测肾组织IgA的表达状况；肾组织切片分别进行苏木素-伊红(HE)染色及过碘酸-希夫(PAS)染色，于普通光镜下观察肾脏病理形态学改变。
　　 结果：模型小鼠免疫组化检测反映IgA在系膜区呈团块状弥漫性沉积，病理上呈典型的系膜增生性肾炎改变。模型小鼠临床上出现典型的蛋白尿，自8周末始24h 尿蛋白定量较正常对照组开始增加，12周末时达高峰（2.32±0.38 mg/24 h）。
　　 结论：口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B的方法能成功构建小鼠IgA 肾病模型，是一种适合国内当前实际的较为理想的造模方法，其成功构建提示黏膜免疫的启动可能参与了IgA 肾病的发生过程。
　　 第二部分IgA分泌细胞在IgA 肾病小鼠体内的异常分布及FTY720 对其的影响
　　 目的：比较分泌IgA的B 淋巴细胞及浆细胞在IgA 肾病小鼠骨髓、Peyer 小结及小肠固有膜等组织的分布差异，并在此基础上给予FTY720 阻断淋巴细胞向骨髓的迁移，观察其对IgA+B 淋巴细胞及IgA+浆细胞的组织分布影响。
　　 方法：诱导小鼠IgA 肾病模型，采用Ficoll 密度梯度离心法分离骨髓及Peyer小结淋巴细胞，采用连续Percoll 密度梯度离心法分离小肠固有膜的淋巴细胞；利用三色流式细胞检测术分别检测IgA、B220、CD38在来自骨髓、Peyer 小结及小肠固有膜的淋巴细胞表面的表达状况，进而得出IgA+B 淋巴细胞及IgA+浆细胞在小鼠骨髓、Peyer 小结、小肠固有膜等组织的分布差异。
　　 结果：
　　 1.骨髓中：IgA+淋巴细胞/总淋巴细胞水平在模型小鼠中较正常小鼠明显增加，IgA+B220+淋巴细胞/IgA+淋巴细胞水平较正常小鼠减少,最终IgA+B220-淋巴细胞/总淋巴细胞水平在模型小鼠中较正常小鼠明显增加；FTY720 处理小鼠IgA+淋巴细胞/总淋巴细胞水平、IgA+B220+淋巴细胞/总淋巴细胞水平及IgA+B220-淋巴细胞/总淋巴细胞水平均较模型组小鼠减少。
　　 2.Peyer 小结中：同正常对照比较，模型小鼠Peyer 小结中IgA+淋巴细胞/总淋巴细胞水平略升高，但是IgA+B220+淋巴细胞/IgA+淋巴细胞水平降低，最终IgA+B220+淋巴细胞/总淋巴细胞水平降低，但统计学上未见显著性差异； IgA+B220-淋巴细胞/IgA+淋巴细胞水平及IgA+B220-淋巴细胞/总淋巴细胞水平略升高，但统计学无明显差异。FTY720 处理小鼠IgA+淋巴细胞/总淋巴细胞水平及IgA+B220-淋巴细胞/总淋巴细胞水平较模型小鼠及对照小鼠明显增高，而IgA+B220+淋巴细胞/总淋巴细胞水平则略有降低。
　　 3.小肠固有膜中：模型小鼠IgA+淋巴细胞/总淋巴细胞水平、IgA+B220+淋巴细胞/总淋巴细胞水平及IgA+B220-淋巴细胞/总淋巴细胞水平均较正常小鼠有所降低，但统计学意义尚不显著；FTY720 处理小鼠IgA+淋巴细胞/总淋巴细胞水平、IgA+B220+淋巴细胞/总淋巴细胞水平及IgA+B220-淋巴细胞/总淋巴细胞水平较正常对照小鼠及模型小鼠均减少。
　　 结论：小鼠IgA 肾病模型骨髓中IgA+B 淋巴细胞及IgA+浆细胞数量出现了增多，而肠道黏膜组织中IgA+B 淋巴细胞数量并未增多，且固有膜中IgA+浆细胞减少，这可能是由于Peyer 小结中本应向固有膜迁移的IgA+B 淋巴细胞出现了转向于骨髓的错位迁移，并在骨髓中发育为产pIgA的浆细胞。FTY720 可诱导IgA+B 淋巴细胞及IgA+浆细胞向Peyer 小结归巢，从而减少骨髓中浆细胞的数量。
　　 第三部分CCL28、SDF-1、MadCAM-1 调节IgA 肾病小鼠体内IgA+B 淋巴细胞及IgA+浆细胞的错位迁移
　　 目的：检测CCL28、MadCAM-1、SDF-1等主要介导淋巴细胞迁移及归巢的趋化因子及黏附分子在Peyer 小结、小肠固有膜、骨髓及肾脏组织的表达状况，以证实淋巴细胞归巢因子在调节IgA 肾病小鼠体内IgA+B 淋巴细胞及IgA+浆细胞的错位迁移及IgA肾病发病机制中所起的作用。
　　 方法：制作小鼠IgA 肾病模型，应用免疫组织化学法检测CCL28 及Madcam-1 小肠中的表达及SDF-1在骨髓、肾皮质的表达，同时应用蛋白免疫印迹法半定量测定Peyer小结及小肠组织中 CCL28、MadCAM-1的蛋白表达量以及骨髓、肾脏组织中SDF-1的蛋白表达量，实时荧光定量PCR法半定量检测小肠组织CCL28、MadCAM-1的 mRNA表达及骨髓、肾脏组织中SDF-1mRNA表达。
　　 结果：
　　 1）免疫组织化学法显示，CCL28 阳性表达见于小肠黏膜固有层，正常小鼠小肠黏膜固有层呈强阳性表达，模型小鼠表达明显减少，经 FTY720 干预小鼠阳性表达较模型小鼠略有增加；MadCAM-1在三组小鼠小肠黏膜固有层均可见阳性表达，模型小鼠及FTY720 干预小鼠阳性表达较正常小鼠少；SDF-1在骨髓的阳性表达以间质明显，三组小鼠均可见阳性表达，但组间差别不显著；SDF-1 肾脏组织的阳性表达主要见于肾小管上皮细胞，在正常小鼠中呈弱表达，在模型组中阳性表达增多，经 FTY720干预小鼠较模型表达减弱。
　　 2）蛋白免疫印迹法发现，在Peyer 小结中，模型小鼠CCL28蛋白表达量较正常小鼠明显降低，MadCAM-1的表达量也明显降低，FTY720 处理小鼠CCL28 及MadCAM-1的蛋白表达较正常小鼠也降低，但同模型小鼠比较无显著性差异；小肠固有膜中，模型小鼠及FTY720 处理小鼠CCL28蛋白表达量均较正常降低，但两组彼此间无显著性差异；同正常对照比较，模型小鼠 SDF-1的蛋白表达量在骨髓中轻微降低，在肾脏中轻微增加，FTY720处理小鼠SDF-1的蛋白表达量在骨髓及肾脏较模型小鼠及正常小鼠均略有增多，但都缺乏统计学意义。
　　 3）实时荧光定量PCR法发现，小肠CCL28 mRNA的表达量在模型小鼠较正常小鼠降低，在FTY720 处理小鼠也较正常小鼠降低，MadCAM-1的表达量在模型鼠降低，在FTY720 处理小鼠有所增加，但是缺乏统计学意义；模型小鼠 SDF-1的mRNA表达量较正常小鼠在骨髓中减少，在肾脏中增加；FTY720 处理小鼠mRNA表达量在骨髓中较模型小鼠增多，在肾脏中较模型小鼠减少，但缺乏统计学意义。
　　 结论：
　　 1）小鼠IgA 肾病时，肠道粘膜组织CCL28 及MadCAM-1表达下调，因而原本应定向小肠固有膜归巢的IgA分泌细胞迁移减少；在骨髓基质细胞产生的CCL28或其他因子或因素作用下，IgA分泌细胞出现了定向骨髓的错位迁移，导致骨髓中IgA分泌浆细胞增多并产生过量的致病性IgA分子。
　　 2）SDF-1 可能并非导致IgA分泌细胞错位迁移的关键分子，SDF-1在IgA 肾病小鼠肾脏的表达增加更可能是机体对肾脏已经出现损伤的一种反应。
　　 3）FTY720与CCL28 及MadCAM-1在小肠粘膜组织的表达紊乱可能并无直接联系，FTY720 减少骨髓中浆细胞的数量与其选择性诱导外周血淋巴细胞向次级淋巴器官归巢有关。
　　 第四部分FTY720 及环孢霉素A 用于IgA 肾病模型小鼠治疗的效果观察
　　 目的：观察FTY720用于IgA肾病模型小鼠治疗的效果，并进行评价。
　　 方法：首先诱导IgA肾病模型，自造模10周后始分别应用FTY720及环孢霉素A干预IgA肾病小鼠，比较FTY720干预组小鼠与IgA肾病模型组小鼠之间在病理及临床表现的差异，同时比较FTY720干预组小鼠与环孢霉素A干预组小鼠之间在病理及临床表现的差异。
　　 结果：12周末时模型组小鼠尿蛋白达高峰，FTY720干预组及CsA干预组尿蛋白虽较正常为高，但较模型组显著下降，二者彼此间无统计学差异；14周末时，FTY720干预组及CsA干预组尿蛋白均较模型小鼠明显降低，与正常小鼠比较均无统计学差异。各组小鼠血生化检测血清TP、ALB、CHOL、Cr无显著性意义。光镜下观察，FTY720干预小鼠及CsA干预小鼠系膜区均可见IgA弥漫性沉积，染色程度较模型组明显浅。病理上 FTY720干预小鼠及CsA干预小鼠均呈系膜增生性肾炎病变，以系膜基质的轻度增生为主，其增生程度远较模型小鼠为轻。
　　 结论：FTY720同CsA一样，对小鼠IgA肾病具有良好的治疗效果。由于FTY720可诱导IgA+B淋巴细胞及IgA+浆细胞向Peyer小结归巢，减少骨髓中浆细胞的数量，从而减少致病性IgA分子的产生，因此FTY720极有可能是一种在病因治疗上针对IgA肾病的有效药物。

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论文说明：英文缩略词

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前 言

第一部分 IgA 肾病小鼠模型的构建及鉴定

第二部分 IgA 分泌细胞在IgA 肾病小鼠体内的异常分布及FTY720 对其的影响

第三部分 CCL28、SDF-1、MadCAM-1 调节IgA 肾病小鼠体内IgA+B 淋巴细胞及IgA+浆细胞的错位迁移

第四部分 FTY720 及环孢霉素A 用于IgA 肾病模型小鼠治疗的效果观察

综述：IgA 肾病动物模型研究进展

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