抑制体外扩增小鼠造血干细胞衰老维持干性:下调异常激活的mTORC1信号

摘要

第一部分mTORC1在造血干细胞体外扩增过程中的活化规律
　　 目的：mTORC1 掌控了细胞多种生命过程，研究表明过高的mTORC1 活性会破坏细胞内坏境平衡。本研究的目的是探讨造血干细胞在体外扩增过程中，胞内的mTORC1 活性的变化规律。
　　 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞，应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞，应用Rapamycin 作为mTORC1 抑制剂，以DMSO 作为对照。扩增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集扩增后细胞，流式检测胞内mTORC1 底物p70 s6k 磷酸化状况。
　　 结果：Lin-Sca-1+细胞在细胞因子的刺激下开始增殖，第6天时细胞扩增了25±4.5倍，到了第10天时，细胞扩增了82±5.2 倍。磷酸化p70 s6k的表达与之相应。在未扩增初始的状态下，只有5.82±3.12％的细胞表达磷酸化p70 s6k，扩增了6天以后，22.4±4.67％的细胞表达磷酸化p70 s6k，而扩增了10天以后，73.4±5.23％的细胞表达磷酸化p70 s6k；在第6天的时候加入Rapamycin 可以有效的抑制磷酸化p70s6k的表达，但是并没有完全抑制磷酸化p70 s6k的表达。
　　 结论：mTORC1在10天的小鼠造血干细胞体外扩增过程当中，前6天呈现一定水平的激活，在扩增的第7-10天呈现一个剧烈激活的过程，这个过程和总细胞的大量扩增相呼应。
　　 第二部分抑制mTORC1 异常活性促进造血干细胞体外扩增以及干性维持
　　 目的：mTORC1 过高活性会导致造血干细胞池的耗竭，而Rapamycin 为m TORC1 有效抑制剂。在上一部分的研究中已经发现mTORC1在扩增7-10天出现剧烈激活过程，本部分研究目的就是利用Rapamycin 抑制mTORC1在小鼠造血干细胞扩增第7-10天呈现的剧烈激活，研究其能否进造血干细胞体外扩增以及干性维持。
　　 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞，应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞，应用Rapamycin 作为mTORC1 抑制剂，以DMSO 作为对照。扩增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集扩增后细胞。利用流式检测细胞的表型，利用CAFCs（Cobblestone Area-Forming Cells）法检测体外造血干细胞的功能，利用竞争性移植的办法检测造血干细胞长期造血能力。
　　 结果：Rapamycin在第6天加入，在扩增结束以后，会略微的减少有核细胞总的数量，Veh组总的有核细胞数量为2.73±0.33×105，而加Rapamycin组总的有核细胞数量为2.43±0.21×105。但是Rapamycin的加入却增高了LSK+细胞和Lin-Sca-1+细胞在总细胞中的比例，通过计算得出总的LSK+细胞和Lin-Sca-1+细胞的数量，我们发现，Rapamycin 相较于Veh可以显著的增加LSK+细胞和Lin-Sca-1+细胞的数量，Veh组分别得到1.27±0.47×104和7.34±3.0×103的Lin-Sca-1+细胞和LSK+细胞，而Rapamycin组则得到1.97±0.56×104和10.64±3.42×103的Lin-Sca-1+细胞和LSK+细胞。当与初始的Lin-Sca-1+细胞比较，计算Lin-Sca-1+细胞扩增的倍数时，Veh组获得了4.2倍的扩增，而Rapamycin 获得了6.5倍的扩增。Rapamycin 相较于Veh获得了1.5倍的Lin-Sca-1+细胞数量。Rapamycin 可以明显的增加day14-CAFCs和day35-CAFCs，可以获得150.67±16.4和9.26±1.45/100，000细胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs，而Veh则只能获得97.3±7.6和3.53±1.02/100，000细胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs。当计算day35-CAFCs扩增倍数时，即相当于计算体外造血干细胞功能时，Veh获得了0.73±0.08倍的扩增，而Rapamycin 获得了1.95±0.25倍的扩增。Rapamycin 扩增后的细胞相较于Veh扩增后的细胞在第8周的时候，能更有效的植入照射模型的小鼠体内Rapamycin组CD45.2细胞的植入率为32.23±10.7％，Veh组的植入率为18.16±9.32％；随着时间的延长至32周，Veh组的植入率有所降低，9.93±8.25％，而Rapamycin组的植入率为42.1±11.2％。
　　 结论：Rapamycin 能够促进体外造血干细胞的扩增，并且增强扩增后细胞造血重建的速度和长期造血重建功能，维持其干性。
　　 第三部分抑制mTORC1 异常活性促进造血干细胞体外扩增的机制探讨
　　 目的：虽然明确了抑制mTORC1异常活性可以促进造血干细胞体外扩增以及干性维持，但是其机制尚不清楚。在其他细胞环境的研究发现mTORC1活性与干细胞的凋亡，分化，衰老密切相关，本研究的目的是探讨抑制mTORC1活性促进造血干细胞体外扩增及干性维持的机制。
　　 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞，应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞，应用Rapamycin 作为mTORC1抑制剂，以DMSO作为对照。扩增10天，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集扩增后细胞。利用流式，免疫荧光，细胞组织化学，聚合酶链式反应检测细胞的周期，衰老等相关分子表达。
　　 结果：通过Annexin-V对凋亡细胞的标记,发现Veh组的总细胞Annexin-V表达率为8.93±1.5％，Rapamycin组的总细胞Annexin-V表达率为11.79±3.7％；在LSK+的细胞群体当中，Annexin-V表达率在Veh组和Rapamycin组分别为2.61±0.57％和2±0.22％。通过CFCs（cloning forming cells）检测发现Rapamycin 对于粒-巨细胞形成集落，爆式红细胞集落的生成没有显著的影响。对衰老表型的研究发现，在未扩增的对照的细胞中，几乎没有发现衰老的细胞，细胞在Veh的处理下，扩增了10天以后，Lin-Sca-1+细胞出现了9.7±1.95％的衰老细胞，但是Rapamycin 非常明显的抑制了衰老细胞出现的频率，为2.4±0.71％。对自噬的研究发现，经过Rapamycin 处理以后，自噬标志性分子LC3b的表达面积显著低于Veh组，甚至比未扩增的细胞还要低；对细胞周期的研究发现，Rapamycin 处理显著的增加了G0期细胞的比例，Veh组的G0期细胞的比例为11.75±3.3％，Rapamycin组的G0期细胞的比例为21.7±3.5％。不仅如此，Rapamycin的处理还减低了p16和p53的表达。
　　 结论：抑制mTORC1活性并没有影响造血干细胞的凋亡和分化，而显著降低了其在扩增过程中出现的衰老。Rapamycin 并没有通过增强自噬来抑制衰老，而是通过调节了一系列的细胞周期动力因子和阻滞因子实现了对衰老的抑制。
　　 第四部分mTORC1和p38 MAPKα在造血干细胞体外扩增过程中的相互对话关系
　　 目的：在以前的研究中发现了抑制p38 MAPKα的活性可以通过抑制衰老促进造血干细胞的体外扩增，而在这里发现了抑制mTORC1的活性也是主要通过抑制衰老的作用而促进了造血干细胞的体外扩增，那么两者的关系究竟如何呢？在这部分的研究当中对mTORC1和p38 MAPKα相互对话关系进行了深入的探讨和研究。
　　 方法：分选小鼠骨髓Lin-Sca-1+细胞，应用无血清培养基添加细胞因子的培养体系体外扩增分选的干祖细胞，应用Rapamycin 作为mTORC1 抑制剂，SB(SB203580)作为p38 MAPKα的抑制剂，以DMSO 作为对照。扩增10天，SB 从第一天开始加，在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后，收集扩增后细胞。通过免疫印迹，免疫荧光，聚合酶链式反应等方法检测相关分子表达情况。
　　 结果：在造血干细胞体外扩增过程当中，抑制mTORC1 对p38 MAPKα没有影响，但是抑制p38 MAPKα活性会反而增强mTORC1的活性。联合抑制mTORC1和p38 MAPKα可以进一步促进造血干细胞的体外扩增。四组比较发现，Veh组获得了1.5±0.3×103，Rapamycin组获得了1.9±0.1×103，SB组获得了2.2±0.2×103，联合处理组获得了2.6±0.14×103的LSK+细胞，以及更多的day35CAFCs，分别为3.4±0.57，7.8±0.32，9.7±0.21，11.4±0.63/100，000个扩增细胞。联合抑制mTORC1和p38 MAPKα，通过对SA-β-gal的研究发现SB和Rapamycin的联合应用明显的进一步降低了衰老表型的表达，只有1.9±0.7％，而单独加入Rapamycin或者SB 则有4.3±2.1％，5.2±1.6％，联合抑制以后p16和p53的表达进一步降低，只有Veh组的0.37±0.05，0.45±0.08 倍。
　　 结论：在造血干细胞过程中抑制mTORC1 对p38 MAPKα活性没有影响，而抑制p38 MAPKα活性会进一步激活mTORC1，同时抑制两条通路可以通过增强抑制衰老达到进一步促进造血干细胞扩增的目的。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分 mTORC1在造血干祖细胞体外扩增过程中的活化规律

第二部分 抑制mTORC1异常活性促进造血干细胞体外扩增以及干性维持

第三部分 抑制mTORC1异常活性促进造血干细胞体外扩增的机制探讨

第四部分 mTORC1和p38 MAPKα在造血干细胞体外扩增过程中对话关系

全文小结

致谢

（附录1）在校期间发表文章情况

（附录2）造血干细胞体外扩增