炎症因子Daintain/AIF-1对胰腺β细胞功能影响的研究

摘要

Daintain（大炎肽）是1994年由Chen等从猪的小肠中分离纯化出的一种新的生物活性蛋白，其氨基酸序列与1995年由Utans等人在大鼠心脏移植排斥反应中克隆出的巨噬细胞因子Allograft Inflammatory Factor-1（同种异体移植炎症因子-1，AIF-1）高度同源（90％），两者属不同物种来源的同一蛋白质，故并称为Daintain/AIF-1。Daintain/AIF-1分子量17kD，主要由激活的巨噬细胞表达和分泌，是一种多功能的细胞因子，广泛参与炎症和免疫相关的多种疾病的发生发展过程，如血管病变、移植排斥、肿瘤以及自身免疫疾病等。
　　1型糖尿病(Type1 Diabetes Mellitum,T1DM)是一种T淋巴细胞介导的自身免疫疾病，以胰岛炎引发的胰岛β细胞的选择性破坏为特征。在发病前的胰岛炎阶段，活化的巨噬细胞、T淋巴细胞等大量浸润胰岛，释放出炎症介质如细胞因子和NO等协同作用，引起β细胞凋亡、坏死以及胰岛素分泌异常等功能损伤，进而发展为T1DM。目前T1DM发病的分子机理还未完全阐明，但大量研究表明炎症和免疫相关的细胞因子在这一进程中起着关键作用。我们的前期研究发现Daintain/AIF-1在正常胰腺组织中不表达，但在T1DM模型BB大鼠侵润胰腺的巨噬细胞中大量表达，表明炎症因子Daintain/AIF-1与T1DM的发病机理有关，但具体机制仍未明确。为了研究Daintain/AIF-1在T1DM发病中的作用，本论文主要开展了以下工作：
　　第一部分：以大鼠β细胞系INS-1为实验模型，在细胞水平上研究了Daintain/AIF-1对T1DM中β细胞功能异常的影响。在细胞培养基中添加不同浓度的Daintain/AIF-1刺激后，检测INS-1细胞活力、凋亡、周期、胰岛素分泌和NO产量的变化，结果发现：
　　1. Daintain/AIF-1对INS-1细胞具有毒性作用，能抑制细胞活力。
　　2. Daintain/AIF-1能够诱导INS-1细胞的凋亡，特别是早期凋亡。提示Daintain/AIF-1可能在凋亡的起始阶段起刺激性作用，最终导致INS-1细胞活力的降低。
　　3. Daintain/AIF-1不影响INS-1细胞的基础胰岛素分泌，但是抑制了20mM葡萄糖条件下的葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）水平，说明Daintain/AIF-1损伤了INS-1细胞的葡萄糖反应性，这是Daintain/AIF-1对INS-1细胞毒性作用的另一个方面。
　　4. Daintain/AIF-1显著提升了INS-1细胞的NO产量，推测NO水平的上升可能和细胞凋亡的增加和GSIS的下降有关，可能是Daintain/AIF-1诱导的β细胞毒性作用的机制之一。
　　5. Daintain/AIF-1影响INS-1细胞周期，将细胞阻滞在G0/G1期，使得进入S期和G2/M期的细胞减少，以此来抑制细胞增殖，且Daintain/AIF-1浓度越大，作用越明显。
　　第二部分：寻找Daintain/AIF-1在胰腺中的相互作用蛋白，为深入了解Daintain/AIF-1对β细胞毒性作用机制提供思路。采用Clontech MatchmakerTM GAL4酵母双杂交系统3来进行人胰腺MatchmakerTM cDNA文库中Daintain/AIF-1相互作用蛋白基因的筛选，主要结果为：
　　1.构建了诱饵质粒pGBKT7-Daintain/AIF-1，经检测可以在AH109酵母中正
　　确表达出诱饵融合蛋白BD-Daintain/AIF-1，对酵母细胞无毒性，且没有自激活性。
　　2.扩增了人胰腺cDNA文库，转化入AH109/pGBKT7-Daintain/AIF-1酵母，涂布SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板并进行β-半乳糖苷酶活性检测，初步筛选出64个Ade+His+lacZ+三阳性候选酵母克隆。
　　3.进行回转实验和一对一验证实验排除假阳性，结果仅获得1种文库质粒。对其cDNA插入片段测序后Blast比对并进行阅读框分析，发现该片段翻译时发生了移码，仅表达出一段32个氨基酸残基的未知小肽段，说明该质粒是假阳性。本次筛选未获得阳性结果，是酵母双杂交系统假阳性率非常高这一重大缺陷的一次实例。
　　综上，本研究首次发现Daintain/AIF-1对INS-1细胞具有毒性作用，Daintain/AIF-1可能通过将细胞阻滞在G0/G1期来抑制细胞增殖，以及上调NO产量来刺激细胞凋亡和损伤胰岛素分泌。这说明细胞因子Daintain/AIF-1促进了β细胞的功能异常，在T1DM的起始和发展中起重要的推动作用。

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1 绪 论

1.1 Daintain/AIF-1：疾病相关的多功能炎症因子

1.2 细胞因子及NO在1型糖尿病中的作用

1.3 酵母双杂交系统在蛋白质相互作用中的研究进展

1.4 本研究的目的与意义

2 Daintain/AIF-1对β细胞功能的影响

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 实验结果与讨论

2.5 小结

3 酵母双杂交技术筛选Daintain/AIF-1在人胰腺中的

3.1 引言

3.2 实验材料与仪器

3.3 实验方法

3.4 实验结果与分析

3.5 小结与讨论

4 全文总结

4.1 主要研究结果

4.2 创新点

4.3 展望

致谢

参考文献

附录1攻读博士学位期间发表的文章

附录2主要缩略词表

附录3氨基酸缩写表