RNA干扰靶向沉默IL-32γ基因对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增值与凋亡的影响

摘要

目的：类风湿关节炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一种以滑膜炎和进行性关节软骨与骨质破坏为主要特征的慢性系统性自身免疫性疾病。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-likesynoviocytes,FLS)增生与凋亡失衡并分泌各种炎症因子在RA免疫发病机制中发挥了关键作用。白介素32(interleukin32,IL-32)是新近发现的一种致炎细胞因子,IL-32γ是IL-32所有亚型中生物学活性最强的。有研究发现其与RA的启动与进展密切相关,但它对RA-FLS生物学特性的影响尚不清楚。本实验通过RNA干扰技术沉默IL-32γ基因研究IL-32γ对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖与凋亡的影响及其机制。
　　方法：体外无菌条件下分离培养类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞(FLS);设计合成IL-32γ的靶向siRNA,用脂质体法转染RA-FLS细胞;RT-PCR法检测转染后细胞内IL-32γ的表达;Western印迹法检测周期蛋白D1(cyclinD1)及蛋白激酶B(p-Akt)的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;TUNEL法检测细胞凋亡。数据采用t检验进行统计分析。
　　结果：①针对IL-32γ序列1、2和3的siRNA均能有效抑制FLS的IL-32γ的表达。②MTT法检测实验组在接种后3天和5天的细胞数量均明显少于对照质粒组和未转染组。③实验组处于G1期的细胞比例为(88.1±6.2)％,较对照质粒组(68.6±4.6)%和未转染组(67.9±4.4)%显著为高(均P<0.05);处于S+G2期的细胞比例为(13.6±3.0)%,较对照质粒组(30.2±4.1)%和未转染组(32.1±4.3)%显著为低(均P<0.01)。④实验组凋亡率为(20.5±3.21)%,较对照质粒组(9.2±0.32)%和未转染组(8.6±0.22)%显著为高(均P<0.01)。⑤实验组cyclinD1和p-Akt的表达明显低于对照质粒组和未转染组。
　　结论：IL-32γ的靶向siRNA转染RA-FLS后,细胞的增殖减少且凋亡增加,说明IL-32γ可以促进RA-FLS的增殖和抑制凋亡,其机制可能与IL-32γ可以上调cyclinD1和p-Akt的表达有关。

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缩略词表

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1 前言

2 实验材料与仪器

2.1组织来源

2.2 主要试剂

2.3 主要实验仪器

2.4 主要器械

2.5 实验试剂的配制

3 实验方法

3.1 RA-FLS的分离和培养

3.2 脂质体法细胞转染

3.3 MTT法检测细胞增值

3.4 RT-PCR检测每组细胞IL-32γ的表达

3.5 Western blot 检测cyclin D1和p-Akt的表达

3.6 流式检测细胞周期

3.7 TUNEL法检测细胞凋亡

3.8. 统计学方法

4 实验结果

4.1 RA-FLS的形态学观察

4.2 基因转染效率

4.3 siRNA转染对FLS增殖的影响

4.4 PCR检测转染细胞IL-32γ的表达

4.5 siRNA对细胞周期的影响

4.6 siRNA-IL-32γ对cyclin D1和p-Akt表达的影响

4.7 siRNA转染对细胞凋亡率的影响

5 讨论

5.1 人滑膜成纤维样细胞的培养

5.2 RNA干扰沉默IL-32γ基因及用PCR检测IL-32γ的表达

5.3 MTT法对细胞增殖的分析

5.4 IL-32γ对FLS细胞周期的影响

5.5 IL-32γ对RA-FLS凋亡的影响

6 结论

参考文献

附录1

附录2

综述

参考文献

致谢