磁分离酶联免疫分析法在日本血吸虫抗体检测中的应用

摘要

日本血吸虫病在我国主要流行于湖南、湖北、江西、安徽、江苏、四川和云南等7个疫区省、市的110个县。根据2009年全国血吸虫病疫情通报,血吸虫病人365770人,其中晚期血吸虫病人28820人,急性血吸虫病人77例,与2008年相比下降了11.42％。目前,我国血吸虫病流行区域感染率和感染度均呈现大幅度下降,粪检在低度流行区漏检率高,近年来广泛采用血清免疫学诊断方法开展筛查,以提高检测的敏感性,已取得了较好的效果。
　　虽然检测循环抗原既能区分现在感染与既往感染,又具有一定的疗效考核价值,但目前检测的测试系统特异性较差,尤其对于慢性轻度感染者,循环抗原检测的敏感性并不理想。血清抗体检测因敏感性高,成本低廉,简便操作,而被广泛用于日本血吸虫病的辅助诊断和疫情检测。血清抗体检测的诊断抗原主要有粗制的成虫或虫卵抗原,纯化及重组抗原。基因重组抗原成本低廉,制备简便,且周期短,方法易于标准化,因此,更适合商品化生产和流行区血吸虫病的血清学辅助诊断。缺少准确、快速、简便、并且适合基层现场应用的血吸虫病检测方法已经成为目前血吸虫病防治研究领域的技术瓶颈,已严重阻碍了我国血吸虫病防治的步伐。
　　磁分离酶联免疫技术(magnetic affinity enzyme-linked immunoassay,MEIA)是由瑞士Serono诊断中心在20世纪80年代中期发明的一种检测新技术。其原理是将磁性分离与酶联免疫分析技术相结合,以高度均匀的磁性微球作为固相支持物,采用磁性微球液相分离取代传统酶联免疫酶标板包被法的固相分离,在外加磁场的作用下迅速地分离游离物和结合物。磁性微球具有颗粒小、表面积大等优点,可结合更多的诊断分子,使蛋白吸附能力超出普通酶标板载体的千倍以上,从而使该方法的敏感性高于以普通酶标板为载体的ELISA方法。而且磁微粒可以利用磁性分离器方便地对所形成的复合物进行收集分离,使得洗涤结果更加彻底、干扰物浓度大大降低及靶物质浓度有效聚集,进而可提高检测方法的信噪比和灵敏度。另外,该方法具有操作简单、使用便捷等特点,因而在免疫学检测中具有较好的应用前景。
　　本研究制备了日本血吸虫可溶性虫卵抗原及基因重组抗原,并将抗原与磁球偶联,建立了基于抗原的磁分离酶联免疫分析法。并将其用于检测轻度感染日本血吸虫病患者血清,治疗后血清及肺吸虫病患者血清,从而为提供一种新的可供选择的方法用于检测日本血吸虫抗体。
　　本论文分为以下三部分:
　　(1)SEA-MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究
　　本研究利用SEA-MEIA法检测感染日本血吸虫血清中的抗体,进而将其与SEA-ELISA结果相比较。研究发现,SEA-MEIA法与SEA-ELISA法检测轻度感染日本血吸虫病患者的敏感性分别是96.55％(56/58)和91.38％(53/58);SEA-ELISA检测为假阴性的5份阳性血清,其中3份被SEA-MEIA检测为阳性;经统计学比较分析,SEA-MEIA比SEA-ELISA具有更高的敏感性(χ2=21.95,P<0.01)。经非参数Pearson’s相关分析,两种方法检测日本血吸虫病患者血清抗体的OD值之间具有显著正相关关系(r=0.845,P<0.01)。SEA-MEIA和SEA-ELISA检测正常人血清均未出现阳性反应(0/30),与肺吸虫病人的血清出现了交叉反应(3/6)。15例轻度感染血吸虫病患者,经吡哇酮治疗后半年收集血清,粪检显示虫卵为阴性。SEA-MEIA与SEA-ELISA检测的抗体转阴率分别为26.67％(4/15)、33.33％(5/15),经统计学比较分析,两种方法的检出率具有显著性差异(χ2=10.909,P<0.01)。结果提示SEA-MEIA法是一种敏感性高、简便快速的日本血吸虫抗体检测方法。
　　(2)日本血吸虫抗原基因的载体构建、原核表达及抗原性鉴定
　　本研究利用基因重组技术成功构建了重组表达载体 pGEX-Sj23突变体,pGEX-Sj23大亲水性片段(pGEX-Sj23-LHD),pET28a-Sj23突变体,pET28a-Sj26及pET28a-Sj14-3-3。
　　含有重组质粒pGEX-Sj23突变体、pET28a-Sj23突变体的表达菌株,在IPTG的诱导下都未见明显的重组蛋白表达。含有重组质粒pGEX-Sj23-LHD的表达菌株在IPTG的诱导下可见重组蛋白的表达,且表达产物经GST免疫亲和层析纯化,SDS-PAGE电泳显示该融合蛋白分子量约34kDa,其中包括寄生虫蛋白LHD约8kDa,载体表达蛋白26kDa。含有重组质粒pET28a-Sj26、pET28a-Sj14-3-3的表达菌株经IPTG诱导后,表达产物经镍柱亲和层析纯化,可获得高纯度的重组蛋白。SDS-PAGE电泳显示该融合蛋白分子量分别约27kDa、31kDa,其中包括6个His-tag,且两种蛋白都主要以可溶性的形式表达。
　　重组蛋白Sj23-LHD、Sj26、Sj14-3-3可特异性的被感染了日本血吸虫的兔血清、小鼠血清所识别,而不能被正常兔血清、正常小鼠血清所识别,且重组蛋白Sj23-LHD可被感染了日本血吸虫3W的小鼠血清所识别。说明纯化的重组抗原具有抗原性,可用于后续的实验研究。
　　(3)基于重组抗原的MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究
　　研究发现,rSj26-MEIA和rSj14-3-3-MEIA都可检测出感染了日本血吸虫小鼠血清中的抗Sj26及Sj14-3-3的特异性抗体,且rSj26-MEIA与rSj14-3-3-MEIA检测为阳性血清的平均OD值与阴性血清的平均OD值之比(P/N)均高于ELISA(3.92versus2.66、3.71 versus2.45)。
　　rSj26-MEIA与rSj26-ELISA检测轻度感染日本血吸虫病人血清的阳性率均为24.14％(14/58),经相关分析,rSj26-MEIA与rSj26-ELISA检测的抗体OD值之间存在正相关关系(r=0.658,P<0.01),这两种方法检测为阳性血清的平均OD值与阴性血清平均OD值之比(P/N)分别为3.61、2.56。rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA检测轻度感染日本血吸虫病人血清的阳性率为22.41％(13/58),经相关分析,rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA检测的抗体OD值之间存在正相关关系(r=0.618,P<0.01),这两种方法检测为阳性血清的平均OD值与阴性血清的平均OD值之比(P/N)分别为3.65、2.71。经统计比较分析,rSj26-MEIA与rSj14-3-3-MEIA的阳性检出率之间没有显著性差异(χ2=3.198,P>0.05)。
　　检测治疗后半年且粪检显示虫卵为阴性的血清,rSj26-MEIA与rSj26-ELISA的阳性检出率均为13.33％(2/15);rSj14-3-3-MEIA与rSj14-3-3-ELISA均没有检出阳性反应(0/15)。基于这两种抗原的MEIA和ELISA检测肺吸虫病人血清(0/6)、正常人血清均未出现阳性反应(0/30)。
　　上述结果显示,基于rSj26和rSj14-3-3的MEIA法与ELISA法检测轻度感染日本血吸虫病具有相似的敏感性,rSj26-MEIA和rSj14-3-3-MEIA具有一定的疗效考核价值及较好的特异性。

目录

封面

声明

目录

前 言

参考文献

中文论著摘要·

中文摘要

英文摘要

缩略语表

·第一部分· SEA-MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究

前 言

材料与方法

结果

讨 论

参考文献

·第二部分·日本血吸虫抗原基因的载体构建、原核表达及抗原性鉴定

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

·第三部分·基于重组抗原的MEIA方法在日本血吸虫抗体检测中的研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

全文小结

综述

1.日本血吸虫病的免疫学诊断方法

2.日本血吸虫病的免疫诊断抗原

参考文献

研究生期间发表的论文情况

致谢

附录Ⅰ重组质粒的测序结果

附录ⅡSj23突变体、Sj23-LHD、Sj26和Sj14-3-3测序序列的比对结果

附录Ⅲ 原核表达载体图谱