Attractin在不育症男性中的差异性表达意义与影响生育机制的初步探讨

摘要

文章主要从以下几部分进行了论述。
　　第一部分Attractin在不育症男性睾丸组织中的表达差异。
　　目的：通过对生育正常与不育症男性患者睾丸组织中Attractin定位与定量表达差异的研究，来探讨Attractin与男性生殖的关系。
　　方法：对生育正常与少弱精子症、原发性非梗阻性无精子症两组不育症男性睾丸组织病理切片分别进行HE染色、免疫组化法(SP)和免疫荧光检查，观察Attractin蛋白在三组男性睾丸组织中的表达。同时采用逆转录-荧光定量PCR(Q-PCR)检测三组男性睾丸组织Attractin mRNA及其同系物Attractin like-1 mRNA的表达差异；Western blot的方法检测Attractin蛋白水平的表达差异。
　　结果：免疫组化与免疫荧光结果显示三组男性睾丸组织内均广泛存在Attractin的表达,主要表达于细胞膜和细胞质，且胞膜表达强于胞质；Leydig细胞、Sertoli细胞、精原细胞、精母细胞及精子细胞均为阳性表达。Q-PCR结果显示生育正常组男性睾丸组织的Attractin mRNA和Attractin like-1 mRNA表达量最高，少弱精子症组表达降低，原发性非梗阻性无精子症组表达最低，三组间比较差异均具有统计学意义。Western blot的结果也显示Attractin蛋白在生育正常组表达高，少弱精子症组表达降低，而原发性非梗阻性无精子症组表达最低，三组间比较差异也具有统计学意义。
　　结论：Attractin蛋白在人类睾丸组织中广泛表达，其在不育症男性睾丸组织中基因水平与蛋白水平的表达均存在差异，具体作用环节尚有待进一步研究。
　　第二部分Attractin在不育症男性精液中的含量差异。
　　目的：检测Attractin在人类精液中是否存在，并比较其在精液参数正常组与少弱精子症组、无精子症组精液中的含量差异，进一步探讨Attractin与男性生殖的关系。
　　方法：不育症男性精液液化后部分进行常规精液分析，按照WHO人类精液检查与处理实验室手册（第四版）标准分为精液参数正常组、少弱精子症组与无精子症组；其余部分精液离心处理后分离为精浆（SP）和精子提取物（SE），应用Western blot的方法检测Attractin蛋白在精浆与精子提取物中的含量，并比较Attractin蛋白在精液参数正常组、少弱精子症组与无精子症组三组精浆中的含量差异；Attractin在精液参数正常组与少弱精子症组精子提取物中中的含量差异；以及采用逆转录-荧光定量PCR（Q-PCR）的方法比较Attractin mRNA、Attractin like-1 mRNA的表达差异。
　　结果：Attractin蛋白在精浆中含量高，在精子提取物中含量低。Attractin蛋白在三组精浆中的含量表现为精液参数正常组含量最高，少弱精子症组含量低，无精子症组中含量最低，三组差异均有显著性；Attractin蛋白在精子提取物中的含量也表现为精液参数正常组含量高，少弱精子症组含量低，差异也具有显著性；Q-PCR结果显示Attractin mRNA在精液参数正常组精子提取物中表达量明显较高，少弱精子症组低，但差异不具有显著性，而Attractin like-1 mRNA也表现为在精液参数正常组精子提取物中表达量明显较高，少弱精子症组低，且结果有显著性差异。
　　结论：Attractin在男性精浆中含量高，在精子提取物中含量低，其蛋白含量与mRNA的表达水平都与精液质量参数相关。
　　第三部分Attractin影响男性生殖的机制的初步研究。
　　目的：通过对不育症男性Attractin表达与睾丸组织中细胞凋亡、精浆中细胞因子的变化关系，对Attractin影响男性生殖的机制作初步探讨。
　　方法：对不育症男性睾丸组织病理切片TUNNEL法测细胞凋亡水平，Western blot的方法检测睾丸组织中凋亡相关因子Caspase2、3、6、Bcl-2、FAS、抗氧化酶SOD1的表达水平变化，并与Attractin的表达变化趋势比较是否一致；用Western blot测不育症男性精浆Attractin的含量，ELISA方法测不育症男性精浆中IL-2;IL-6;TNF-α的浓度，并比较细胞因子含量变化与Attractin浓度变化是否一致。
　　结果：男性睾丸组织中凋亡相关因子Caspase2、3、6、FAS在生育正常组表达低，少弱精子症组表达较高，而原发性非梗阻性无精子症组最高，与Attractin的表达趋势相反；而凋亡抑制因子Bcl-2和超氧化物歧化酶SOD1均为在生育正常组表达高，少弱精子症组表达较低，原发性非梗阻性无精子症组最低，与Attractin的表达趋势相同。精浆中细胞因子浓度变化趋势与Attractin的含量不同，Attractin在精液参数正常组精浆中含量最高，少弱精子症组较低，无精子症组最低，三组间差异均有显著性；而细胞因子IL-2在少弱精子症组含量最高，在精液参数正常组与无精子症组精浆中含量无差异；IL-6，TNF-a在精液参数正常组含量最低，与少弱精子症组和无精子症组相比差异均有显著性，而在无精子症组与少弱精子症组中含量都高，两组之间无差异。
　　结论：推测Attractin可能主要通过调节男性性腺细胞凋亡和氧化应激参与精子发生，影响男性生殖；少弱精子症和无精子症所导致的男性不育可能与生殖道慢性炎症引起的细胞因子浓度变化有关，而Attractin与精浆中细胞因子浓度变化的关系尚有待于进一步研究证实。

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英文摘要

前 言

正 文

第一部分 Attractin在不育症男性睾丸组织中的表达差异

实验一 Attractin蛋白在不育症男性睾丸组织中的定位研究材料与方法

实验二 Attractin mRNA和Attractin like-1 mRNA

实验三 Attractin蛋白在不育症男性睾丸组织中的表达

参考文献

第二部分 Attractin在不育症男性精液中的含量差异

实验一 Attractin在男性精液精浆与精子提取物中的含量差异

实验二 Attractin蛋白在不育症男性精浆中的含量差异

实验三 Attractin在不育症男性精子提取物中的蛋白含量差异

实验四 Attractin mRNA与Attractin like-1mRNA在不育症男性精子提取物中的表达差异

参考文献

第三部分 Attractin影响男性生殖的机制的初步探讨

实验一 Attractin与不育症男性睾丸组织细胞凋亡的关系

参考文献

实验二 Attractin与不育症男性精浆中细胞因子的关系

参考文献

总 结

参考文献

英文缩略词一览表

附 录

致谢