角膜上皮干细胞与基质微环境细胞的紧密连接及其机制的研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分角膜缘上皮干细胞通过SDF-1/CXCR4信号吸引基质微环境细胞从而阻止其终末分化
　　目的:探索角膜缘上皮干细胞与其基质微环境细胞的紧密连接及其机制。
　　方法:用胶原酶消化分离角膜缘的细胞;在胚胎干细胞培养液中,分离的单个细胞被种到三维 Matrigel上。在部分培养中加入 AMD3100,CXCR4中和性抗体或者 CXCR7中和性抗体。干细胞标志物用实时定量 PCR、免疫荧光染色、免疫印迹方法检测;干细胞克隆生长用3T3滋养细胞克隆形成率测定。
　　结果:胶原酶不仅分离完整的角膜上皮细胞,而且分离到与上皮基底层紧紧相邻的基质细胞。在三维 Matrigel上,单个上皮细胞与基质细胞相互结合,最终形成球形体。角膜缘上皮细胞表达 SDF-1,角膜缘基质细胞强表达 CXCR4。当用CXCR4抑制剂以及中和性抗体时,上皮-基质细胞的结合被抑制,产生的球形体直径变小,上皮细胞表达上皮干细胞标志物 p63α减少,表达更多的分化标志物 CK12,在3T3细胞上形成的大克隆(Holoclone)也减少。当加入 CXCR7中和性抗体时,球形体的形成不受影响。结论:角膜缘上皮细胞通过 SDF-1/CXCR4信号吸引角膜缘基质微环境细胞从而阻止上皮分化。这种球形体生长的体外模型可以用于研究角膜缘上皮细胞在基质微环境中的调控。
　　第二部分 分离与扩增角膜缘基质微环境细胞
　　目的:分离与扩增角膜缘基质微环境细胞,并证明这些基质细胞表达胚胎干细胞的标志物是支持角膜缘上皮干细胞未分化状态的必要条件。
　　方法:人角膜缘细胞分别用中性蛋白酶和胶原酶分离。在胚胎干细胞培养液中,分离的单个细胞分别种到包被、二维、三维 Matrigel上,并用连续传代的方法扩增。同时选择含血清的培养液(SHEM、DMEM+10％ FBS)作为对照。干细胞标志物用实时定量 PCR、免疫荧光染色、免疫印迹检测;干细胞克隆生长用3T3滋养细胞克隆形成率测定。
　　结果:中性蛋白酶可以分离完整的角膜上皮层,而胶原酶不仅分离角膜上皮层,而且分离到紧邻角膜上皮基底细胞的角膜基质细胞,免疫荧光染色显示这些细胞表达胚胎干细胞及其它一些干细胞标志物例如Oct4,Sox2,Nanog,Rex1,SSEA4,N-Cadherin和CD34。在三维 Matrigel中,PCK+的上皮细胞与 Vim+的基质细胞相结合形成球形体,细胞增殖缓慢;在包被的培养板以及二维 Matrigel上,见大量的梭形细胞增殖。用胚胎干细胞培养液连续传代的时候,上述干细胞标志物逐渐减少,第四代细胞被种入三维 Matrigel的时候,上述干细胞标志物又可以重新表达。对比其它培养液中分离的基质细胞,胚胎干细胞培养液中扩增的基质细胞与上皮细胞形成的球形体表达最多的上皮干细胞标志物 p63α,最少的分化标志物 CK12,在3T3细胞上形成最多的大克隆(Holoclone)。
　　结论:角膜缘微环境细胞可以被纯化、分离;这些基质细胞表达胚胎干细胞的标志物是支持角膜缘上皮干细胞的必要条件。这些细胞可以用来研究角膜上皮干细胞的微环境调控。

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声明

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前 言

参考文献

中文摘要

英文摘要

第一部分 角膜缘上皮干细胞通过SDF-1/CXCR4信号吸引基质微环境细胞从而阻止其终末分化

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 分离与扩增角膜缘基质微环境细胞

材料和方法

结果

讨论

参考文献

研究小结

角膜缘上皮干细胞微环境的研究进展

1. 角膜缘上皮干细胞微环境的定位

2. 角膜缘微环境对上皮干细胞的调节作用

3. 角膜缘微环境破坏导致角膜上皮干细胞缺陷

4. 分离角膜缘上皮干细胞及其微环境细胞

5. 角膜缘微环境对上皮干细胞的调节的信号通路

6. 总结与展望

参考文献

附录：攻读博士学位期间发表的论文目录

致谢