儿童急性白血病RIZ1基因表达及启动子甲基化状态的实验研究

摘要

急性白血病(acute leukemia,AL)是儿童时期最常见的恶性肿瘤性疾病,由于联合化疗和支持治疗的不断完善,白血病患儿的长期生存率已得到显著提高,然而复发仍是儿童白血病治疗失败的最重要原因,因此白血病的发病机制亟待进一步阐明。
　　视网膜母细胞瘤蛋白结合锌指结构基因1(retinoblastoma protein-interactingzinc finger gene1,RIZ1)是近来新发现的抑癌基因(tumor suppressor genes,TSGs),在多种肿瘤中表达下调甚至沉默,但在血液系统恶性疾病中的研究有限。DNA甲基化(DNA methylation)作为表观遗传学(epigenetics)的代表,在不改变DNA序列的前提下,通过改变染色质的构象导致抑癌基因表达关闭,参与肿瘤发生的过程,因而成为肿瘤发病机制的研究热点。DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)是维持和催化甲基化的关键酶。DNMTs在多种肿瘤中表达上升,在肿瘤形成的过程中发挥关键作用。
　　本研究检测急性白血病患儿在初诊、缓解及复发阶段RIZ1基因的表达情况,RIZ1启动子区域CpG岛的甲基化状态,结合患者临床特征,探讨抑癌基因RIZ1在儿童白血病发生中的作用,DNA甲基化对RIZ1表达的影响;还通过检测DNMTs的表达水平,分析DNMTs与RIZ1表达变化的关系,探讨DNMTs对急性白血病发生的影响。
　　第一部分RIZ1基因在儿童急性白血病的表达改变
　　目的:探讨RIZ1基因在儿童急性白血病患者中的表达情况及临床意义,以初步了解RIZ1基因在急性白血病中的作用。
　　方法:应用实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测92例ALL和64例AML患者骨髓中RIZ1基因的mRNA表达水平,其中男性77例,女性79例,平均年龄6.43岁。分析RIZ1表达与临床特征的关系。采集13例非恶性血液疾病患儿骨髓作为对照组。
　　结果:按照CCLG-ALL2008和中华医学会儿科学分会血液学组《儿童急性髓细胞白血病诊疗建议》进行危险度分型,ALL患儿分为标危组(SR)59例、中危组(MR)17例以及高危组(HR)16例,AML患者分为低危组(LR)32例、中危组(MR)15例和高危组(HR)17例。ALL患者中,初诊41例、缓解46例、复发6例;AML病人中,初诊29例、缓解29例、复发5例及未缓解1例。与对照组相比,ALL和AML患儿中RIZ1基因表达下调的病人各占92.4％和96.9％。ALL患者在缓解、初诊和复发阶段,RIZ1表达水平依次降低(P<0.01);T-ALL表达水平低于B-ALL,但没有统计学差异;SR、MR和HR各组的mRNA表达水平逐渐降低(P<0.001)。AML病人中,缓解、初诊和复发阶段RIZ1表达水平依次降低(P<0.01),但初诊和复发病人表达差异无统计学意义;LR、MR和HR的mRNA表达水平依次降低(P<0.001)。33例ALL和22例AML患者化疗前后自身对照分析,达到完全缓解时RIZ1表达均明显升高(P=0.005和P<0.001)。AML患者mRNA整体表达水平和在初诊、缓解、复发阶段表达水平均低于ALL病人,且具有统计学差异。
　　结论:RIZ1基因在儿童ALL和AML中表达下调,RIZ1表达下降可能是白血病的不良预后因素。
　　第二部分急性白血病RIZ1基因启动子区域甲基化状态
　　目的:探讨儿童白血病患者RIZ1基因启动子区域CpG岛甲基化状态与RIZ1表达下调的关系,以及甲基化在白血病发生过程中的作用。
　　方法:应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)和亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing)的方法检测64例ALL和32例AML患儿RIZ1基因启动子区域CpG岛甲基化状态,其中男性患者46例,女性50例,平均年龄6.43岁。分析DNA甲基化与RIZ1基因表达下调的相关性,以及对临床预后的影响。采集9例非恶性血液疾病患儿骨髓作为对照组。
　　结果:按照前述标准进行危险分级,ALL患儿分为SR40例、MR11例、HR12例;AML患者分为 LR12例、MR7例和HR13例。ALL患者中,初诊32例、缓解26例、复发6例;AML病人中,初诊16例、缓解10例、复发5例、未缓解1例。27例急性白血病患儿的RIZ1基因启动子CpG岛出现甲基化,甲基化率为28.1％,其中ALL为23.4％、AML为37.5％;而9例对照组病人均为非甲基化状态。ALL患者中,复发、初诊和完全缓解病人的甲基化率依次降低(P=0.006);B-ALL和T-ALL患者的甲基化率无明显差别(P=0.565);随着危险度增加SR、MR、HR甲基化率逐渐升高,且有统计学差异(P=0.003)。AML病人中,复发、初诊和完全缓解患儿甲基化率依次降低,但不具有统计学差异(P=0.303);12例LR组患者均未检出甲基化,LR、MR、HR组甲基化率依次增加(P=0.002)。甲基化患者的RIZ1表达水平明显低于非甲基化者(P<0.001)。
　　结论:RIZ1基因甲基化现象在儿童白血病尤其是ALL中并不常见,但仍是RIZ1表达降低的重要原因之一,RIZ1基因启动子区域DNA甲基化与儿童急性白血病的发生发展相关,并且可能提示预后不良。
　　第三部分DNA甲基转移酶活性变化与RIZ1表达相关研究
　　目的:研究DNA甲基转移酶(DNMTs)在ALL和AML患儿中的表达情况,探讨其与RIZ1基因表达下调以及CpG岛甲基化的相关性。
　　方法:通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测DNMTs三种亚型(DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)在41例ALL和29例AML初诊患儿骨髓中的表达情况。男性和女性均为35例;平均年龄6.25岁。收集13例非恶性血液疾病患儿骨髓作为对照组。
　　结果:与对照组相比,ALL患者的DNMT1基因表达水平上调3.86倍,DNMT3a上升4.44倍,DNMT3b升高8.21倍,;AML患者的DNMT1基因表达水平升高4.35倍,DNMT3a上升4.57倍,DNMT3b上调9.08倍,差异均具有统计学意义(P<0.001)。ALL患儿中,HR组的DNMT1基因表达显著高于SR组(P=0.046),但DNMT3a和DNMT3b的表达均无明显差异。同样的结果见于AML的LR组和HR组患者(DNMT1:P=0.05)。在ALL患者中,甲基化患儿的DNMT1、DNMT3a和DNMT3b表达均高于非甲基化病人(DNMT1:P=0.015;DNMT3a:P=0.038;DNMT3b:P=0.003)。AML患者中,甲基化患儿的DNMT1和DNMT3b表达高于非甲基化病人(DNMT1:P=0.007;DNMT3b:P<0.001),而DNMT3a表达无明显差异(P=0.131)。
　　结论:儿童急性白血病患者的DNMTs表达水平显著升高,甲基化患儿表达明显上调,提示DNMTs表达上调可能是RIZ1基因启动子甲基化的原因,参与白血病的发生过程。

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中文摘要

英文摘要

前言

参考文献

第一部分 RIZ1基因在儿童急性白血病的表达改变

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分 急性白血病RIZ1基因启动子区域甲基化状态

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第三部分 DNA甲基转移酶活性变化与RIZ1表达相关研究

前 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

全文总结

综 述

引 言

1. 表观遗传学与DNA甲基化

2. DNA甲基化与肿瘤

3. DNA甲基化与儿童急性白血病

4. 预后评估和微小残留病

总结与展望

参考文献

英文缩略词表

附录 攻读学位期间发表学术论文和专著

致谢