The Expression,Functions and Mechanisms of Neuroglobin in Hepatocellular Carcinoma

摘要

肝癌居世界恶性肿瘤发病率的第六位,致死率居第三位,其中以肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)为最常见的组织学类型。绝大部分病例发生在各种原有慢性肝病尤其是肝硬化的基础上,主要病因包括慢性肝炎病毒感染、黄曲霉毒素B1摄入、酗酒及非酒精性脂肪肝等。目前肝癌发生发展的机制尚不完全清楚,可能的分子机制包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活、DNA分子的损伤及染色体的不稳定等。此外,氧化应激损伤独立作为HCC发生发展的一个重要病因已经成为目前科研的一个热点。脑红蛋白(Neuroglobin,Ngb)作为血红蛋白家族的新成员,是新近发现的胞内氧化应激感应及信号转导蛋白,目前的研究报道指出其可能具有胞内活性氧物质(Reactive Oxygen Species,ROS)清除剂的活性。最近的一些研究也提示脑红蛋白与肿瘤发展间存在某种关联,但深入的机制研究尚还缺乏。
　　本研究采用肝癌患者手术切除标本、HCC细胞系及裸鼠作为实验材料和研究对象,利用细胞培养、分子生物学、流式细胞分析和组织形态学等研究技术和方法,进一步探讨了脑红蛋白对肝癌发生发展的作用及潜在的分子机制。
　　研究发现:
　　1)人肝癌组织中脑红蛋白的表达较癌旁组织中的表达显著下调。
　　免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)的方法检测了6种常见人类肿瘤组织中脑红蛋白的表达,结果发现脑红蛋白在肝细胞肝癌中表达的阳性率为36.7％(22/60)较癌旁组织的阳性率75.0％(36/48)显著下调。进一步采用实时荧光定量RT-PCR(Real time RT-PCR)检测17例人肝细胞肝癌组织中脑红蛋白mRNA的表达水平亦较癌旁低。
　　2)外源性稳定表达脑红蛋白的肝癌细胞的活力/增殖及软琼脂克隆形成能力下降。
　　噻唑蓝(MTT)及软琼脂克隆形成实验(Colony formation in soft agar)检测到稳定表达脑红蛋白的HepG2细胞增殖及软琼脂克隆形成能力较空载体对照显著下降。
　　3)靶向si-RNA敲除内源性脑红蛋白的表达增强了肝癌细胞的活力/增殖及软琼脂克隆形成能力。
　　噻唑蓝(MTT)及软琼脂克隆形成实验(Colony formation in soft agar)检测到稳定敲除脑红蛋白的HepG2细胞增殖及软琼脂克隆形成能力较空载体对照显著提高。
　　4)动物实验发现,稳定表达脑红蛋白能够抑制裸鼠皮下嫁接肝癌瘤体的生长,而敲除内源性脑红蛋白的表达促进了瘤体的生长。
　　5)脑红蛋白下调了Raf-1/MAPK信号通路活性从而抑制肝癌细胞的增殖及G0/G1-S细胞周期的演进。
　　运用EdU结合实验(EdU incorporation assay)和流式细胞分析技术检测细胞周期的方法检测到稳定表达/敲除脑红蛋白抑制/促进了肝癌细胞的增殖及G0/G1-S细胞周期的演进。同时运用免疫印迹(Immunobloting,IB)的方法检测到稳定表达/敲除脑红蛋白下调/上调了肝癌细胞内Raf-1/MAPK级联反应的活性。进一步研究发现,敲除脑红蛋白的肝癌细胞中加入Raf-1/MAPK级联中关键激酶的抑制剂,脑红蛋白对肝癌细胞增殖的抑制作用被阻断。
　　6)脑红蛋白偶联氧化应激信号(Oxidative stress signal)从而调控了肝癌细胞的增殖;
　　还原型谷胱甘肽是体内重要的还原性保护剂,通过对其在胞内含量的监测,可以间接的反映细胞内ROS的水平及细胞拮抗氧化应激损伤的能力。考虑到脑红蛋白具有内源性活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS)清除剂的活性,研究检测了脑红蛋白对肝癌细胞系中内源性还原型谷胱甘肽水平的影响。结果发现,脑红蛋白显著提高了肝癌细胞内内源性还原型谷胱甘肽的水平。进一步外源性的加入活性氧物质的拮抗剂还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH),使用EdU结合试验检测肝癌细胞的增殖,结果发现外源性还原型谷胱甘肽降低了脑红蛋白对肝癌细胞增殖的抑制作用。
　　此外,根据目前对脑红蛋白结构与功能的研究,选择性的失活突变了脑红蛋白配体连接位点及鸟苷酸解离抑制剂(Guanine nucleotide dissociation inhibitor, GDI)活性位点,结果发现脑红蛋白配体连接位点的突变子(Variants)丧失了脑红蛋白抑制肝癌细胞增殖的活性,而鸟苷酸解离抑制剂活性位点突变体对脑红蛋白抑制肝癌细胞增殖的活性影响不明显。进一步将外源性将抗氧化剂-还原型谷胱甘肽加入不同的脑红蛋白的突变体中,结果发现,抗氧化剂使脑红蛋白配体连接位点突变子重新获得了抑制肝癌细胞增殖的活性。提示脑红蛋白通过偶联氧化应激信号调控着肝癌细胞的增殖,其功能主要依靠其配体连接位点发挥作用,推测脑红蛋白在肝癌发生发展过程中可能通过其内源性ROS清除剂(Endogenous ROS scavenger)的活性发挥其生物学功能。
　　由此得出以下结论:在HCC的发生发展过程中脑红蛋白可能扮演了潜在的抑癌基因作用,其机制主要通过偶联氧化应激信号、发挥其内源性活性氧物质清除剂的活性及下调Raf-1/MAPK信号通路负性调控HCC细胞的增殖。考虑到下游Raf-1/MAPK级联在胞内调控肝细胞肝癌增殖的重要作用,脑红蛋白可能为 HCC的药物治疗提供了一个新的靶点。

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中文摘要

英文摘要

前 言

材料和方法

1. 主要仪器

2. 主要试剂

3. 抗体

4. 石蜡切片制作过程及原理29

5. 免疫组织化学的实验原理和步骤29

6. 细胞培养和转染

7.质粒的扩增

8. 免疫印迹技术

9. 逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）

10. 细胞活力和软琼脂克隆形成实验

11. EdU 结合试验和细胞周期的检测

12. 动物实验

13.统计学分析

结 果

1. 肝癌组织中脑红蛋白的表达较癌旁组织中的表达特异性下调

2. 外源性稳定表达脑红蛋白的肝癌细胞活力及软琼脂克隆形成能力下降。

3. Si-RNA靶向敲除内源性脑红蛋白的表达增强了肝癌细胞的活力及软琼脂克隆形成能力。

4. 体内实验发现，脑红蛋白抑制裸鼠体内嫁接肝癌瘤体的生长

5. 脑红蛋白抑制肝癌细胞的增殖及G0/G1-S细胞周期的演进。

6. 脑红蛋白下调了Raf-1/MAPK信号通路活性从而抑制了肝癌细胞的增殖

7. 脑红蛋白偶联氧化应激信号（Oxidative stress signal）从而调控了肝癌细胞的增殖；

讨 论

小 结

创 新 点

参考文献

综 述

一．肝细胞肝癌发生的分子病理机制

二、氧化应激作为独立的病因与肝细胞肝癌发生发展的关系

三、细胞信号通路作为HCC治疗靶点的研究现状和前景

参考文献

致谢