缬沙坦与类膜介质的相互作用及1型血管紧张素Ⅱ受体的NMR研究

摘要

缬沙坦（Valsartan, VST）是一种广泛应用于临床的抗高血压药物，通过选择性的拮抗1型血管紧张素Ⅱ受体(AT1)达到降压功效。由于AT1受体的结构尚未得到解析，因此VST虽然疗效确切，但是药物与受体的相互作用机制尚不清楚。目前普遍认为，沙坦类药物首先渗入细胞膜继而与膜内的AT1受体结合。在此过程中实际上包含了药物，生物膜，受体三个对象间复杂的相互作用。核磁共振的方法(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)能够在原子分子水平上得到分子间相互作用的多种信息，因此本论文中我们以VST为探针，运用NMR方法研究了药物与胶束类膜体系的相互作用，并且对受体蛋白AT1跨膜区多肽的样品制备以及胶束中液体NMR结构的解析进行了初步的探索。
　　研究药物与膜的相互作用是深入探索沙坦类药物拮抗机制的第一步。我们利用多种表面活性剂形成的胶束体系模拟生物膜环境，综合运用NMR和分子动力学模拟的方法，研究了VST在到达靶蛋白之前在膜上的渗透过程。我们观察到在DPC胶束中，VST存在两种构象（反式和顺式）NMR时间尺度上的快交换现象。VST质子化学位移，弛豫时间，自扩散系数的变化反映出两种构象都与DPC存在较强的相互作用。从分子动力学模拟以及NOESY谱图中揭示的结合态VST的空间结构显示，VST与DPC的疏水长链以及带正电荷的胆碱头都存在相互作用，使得VST定位在富含带电荷亲水头的胶束上层区域。另外，在DPC胶束中，VST两种构象反式：顺式的浓度比为0.94，这一结果与理论计算显示的顺式相比于反式VST具有较低的DPC结合自由能相符，反映了两者与DPC相似的亲和能力。在此基础上，我们比较了CTAB、Tween-20、SDS胶束中VST两种构象的比例（反式：顺式），并按照该比例的大小将表面活性剂进行排序，即DPC，CTAB　　AT1受体属于GPCR家族，是七次跨膜蛋白，分子量大难以表达，结构迄今无法得到解析。我们通过原核表达和化学合成等手段对AT1受体的活性片段进行了研究，取得一些探索性结果。根据跨膜蛋白的各片段可以单独形成稳定结构的理论模型，我们将直接参与相互作用的第五跨膜区(AT1TM5)多肽作为独立的结构单元，对其进行原核表达及纯化，获得了高纯度、大量表达的融合蛋白。结果表明，MBP标签对跨膜多肽的溶解性有明显改善，并且选择合适的跨膜区长度对多肽的表达影响重大。我们根据氨基酸的亲疏水性质，设计并固相合成了第三跨膜区(AT1TM3)多肽，采集并归属了AT1TM3在DPC胶束中的同核二维NMR谱图。结果显示，DPC中AT1TM3多肽NMR信号仅有Leu19-Lys29片段可以分辨，且该片段没有形成为稳定的二级结构。由此说明，多跨膜区的独立折叠模型可能不是普适性的，而且如何选择合适的表面活性剂仍是膜蛋白结构研究中的一个瓶颈。我们的研究为理解AT1受体的折叠机制提供了一些有益的尝试。

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1 I型血管紧张素II受体及其拮抗剂简介

1.1 I型血管紧张素II受体

1.2 I型血管紧张素II受体拮抗剂

1.3 I型血管紧张素II受体与配体相互作用的研究

1.4 总结

2 药物与膜或膜蛋白间相互作用的NMR研究方法简介

2.1 核磁共振波谱学（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）原理简介

2.2 适合NMR研究的模拟膜体系

2.3 药物与模拟膜体系相互作用的NMR研究

2.4 药物与膜蛋白或多肽相互作用的NMR研究

2.5 总结

3 利用NMR以及分子动力学模拟研究缬沙坦与

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.3 结果与讨论

3.4 结论

4 AT1第五跨膜区肽段TM5的表达和纯化

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.3 结果与讨论

4.4 总结

5 AT1第三跨膜区肽段的化学合成及其在DPC胶束中

5.1 前言

5.2 材料和方法

5.3 结果与讨论

5.4 小结

6 总 结

致谢

参考文献